氮肥/花生饼肥配施对番茄根际土壤及根系内生细菌群落结构的影响

庞师婵王帅帅张文静黄子粤覃仁柳肖健唐小付杨尚东

1.广西大学农学院/植物科学国家级实验教学示范中心，南宁 530004； 2.陕西省榆林市蔬菜产业发展中心， 榆林 719000

番茄富含番茄红素,拥有强抗氧化功能，具有提高机体免疫、延缓衰老的作用；同时，番茄中富含苹果酸、柠檬酸和各种糖类，对调整胃肠功能、降低胆固醇以及减缓高血脂症状颇有益处[1-2]。番茄是广西“南菜北运”和“西菜东调”的重要蔬菜品种之一。但随着其生产规模逐年扩大[3]，以及长期不科学地施肥，导致广西番茄产区土壤氮、磷、钾养分比例失衡,土壤酸化加剧，青枯病等土传病害频发，连作障碍发生严重[4-5]。生产者为了保持和提高番茄产量，盲目地施用化肥与农药；其中，氮肥的过量施用问题尤其突出。据统计，我国部分蔬菜产地全年氮肥施用量高达1 732 kg/hm2，蔬菜施用的氮肥其一半的氮素直接挥发，并有5%～10%流失[6]。过量施用氮肥不仅导致地表水富营养化，还会引起地下水硝酸盐污染[7]。目前,如何提高我国蔬菜生产中的氮肥利用率，减量施用氮肥是蔬菜生产中的一个重要研究方向。研究表明，科学合理地施肥不仅可以有效地提高土壤肥力，而且有助于维护土壤健康[8]；其中，有机肥和化肥配施不仅可以提高作物产量和品质，而且有助于增加土壤肥力、维护土壤健康[9-10]。同时，土壤微生物对土壤理化性状的变化非常敏感，至今已被广大科技工作者用作反映土壤肥力状况及质量评价的生物学指标[11]。根际土壤细菌作为根际微生态环境的重要组成部分，对土壤环境变化十分敏感，同时在植物根际土壤有机质的分解、氮的固定以及土壤养分转化过程中发挥着重要的作用[12]。另一方面，植物内生细菌分布在植物各个部位，不仅具有种属多样性特征，而且具有固氮[13-14]、解磷[15]、产生植物生长调节物质[16]、增强宿主抗性[17]和生物修复[18]等功能，对调节宿主体内的微生态平衡、增强抗逆性和促进宿主植物的健康生长发挥着重要作用[19-20]。为此，本研究设置不施肥(A)、100%氮肥(B)、75%氮肥/25%花生饼肥(C)、50%氮肥/50%花生饼肥(D)、25%氮肥/75%花生饼肥(E)及100%花生饼肥(F)共6组处理，基于高通量测序技术，分析番茄植株根际土壤及根系内生细菌多样性，旨在为番茄生产中科学施用氮肥提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

“樱粉1号”番茄种子来自广西大学农学院；花生饼肥购于南宁市农贸市场，含氮量为5.84%；氮肥(尿素)购置于光耀农资园艺，含氮量为46.4%。本试验于2018年9月至2019年12月在广西大学农学院蔬菜生产基地(东经108°18′，北纬22°51.2′)进行。试验根据番茄全生育期所需氮量约8 g[21-22]进行施肥，按7∶3的比例分基肥、追肥分2次施肥。基肥配施于番茄移栽前，追肥从第一花序肥大期开始进行，追肥时根据表1追肥量，撒施于植株根系周围后等量覆土；同时，不施肥处理亦做相同的等量覆土处理。试验设计见表1。

表1 试验设计及施肥量Table 1 Experimental design and fertilizer application g

定植土壤pH 5.50，有机质含量6.20 g/kg，全氮0.86 g/kg，全磷0.54 g/kg，全钾14.5 g/kg，碱解氮57.3 mg/kg，速效磷3.56 mg/kg，速效钾80.6 mg/kg。试验期间除草灌溉、病虫害防治等管理措施按常规方法进行相同管理。

1.2 样品采集与分析方法

育苗至长出第3片真叶时移栽。番茄定植至果实成熟,进入采收期后随机取样。每个处理均随机取9株番茄根际土壤，混合3株土样为1个重复，即每个处理3个重复。采用抖根法[23]采集各个施肥处理番茄根际土壤，装入无菌袋的后混匀。样品经孔径2 mm的筛网过筛后，装入无菌袋，用于分析土壤细菌群落结构。番茄根系经灭菌蒸馏水洗涤、沥干后，装入无菌袋，用于内生细菌分析。

根际土壤细菌及根系内生细菌群落结构分析由上海美吉生物医药科技有限公司使用 Miseq[24]平台进行高通量测序。原始数据上传至NCBI数据库中比对。

1.3 数据处理

采用Excel 2013和SPSS 20.0统计软件对试验数据进行统计分析，多重比较采用邓肯氏新复极差检验法(Duncan’s multiple ranger test，DMRT)。利用生物科技公司提供的云数据分析平台I-sanger进行Alpha多样性及物种组成Venn图分析。采用Shannon指数和Simpson指数表征番茄根际土壤细菌和根系内生细菌多样性，Chao1指数指示细菌丰富度。

2 结果与分析

2.1 样本序列数据分析

由表2可知，与不施肥处理(A)相比，施肥处理均不同程度地改变了番茄植株根际土壤细菌和根系内生细菌不同分类水平数量；其中，氮肥与饼肥配施对根际土壤细菌和根系内生细菌不同分类水平的影响总体上呈提升效果；但单一的氮肥或饼肥处理，虽然提高了番茄植株根际土壤细菌不同分类水平数量，但整体上均导致根系内生细菌不同分类水平数量下降。

表2 不同施肥处理番茄植株根际土壤和根系内生细菌的不同分类阶元归类数量Table 2 Number of endophytic bacteria in rhizosphere soil and root of tomato under different fertilization treatments

2.2 细菌多样性分析

与不施肥处理(A)相比，不同施肥处理对番茄植株根际土壤细菌多样性Shannon 和Simpson指数无显著影响，但对丰富度Chao1指数的影响效果各异。单一的氮肥(B)和低比例的饼肥处理(C)具有降低番茄植株根际土壤细菌丰富度的趋势(表3)。

另一方面，与不施肥处理(A)相比，单一的氮肥和饼肥处理(B和F)不仅导致番茄植株根系内生细菌多样性显著降低，而且还导致根系内生细菌丰富度显著降低；此外，氮肥与饼肥配施对番茄根系内生细菌多样性和丰富度的影响效果依氮肥与饼肥的配比而异，提升效果最优的施肥处理为75%的氮肥和25%的饼肥配比，其次为氮肥和饼肥配比各占50%的处理(D)(表3)。

表3 不同施肥处理番茄植株根际土壤和根系内生细菌Alpha多样性指数Table 3 Alpha diversity index of endophytic bacteria in rhizosphere soil and root of tomato under different fertilization treatments

综上，施肥处理不仅影响番茄植株根际土壤细菌的多样性与丰富度，也对植株根系内生细菌的多样性与丰富度有重要影响；单一的化肥或饼肥施用导致番茄植株根际土壤或内生细菌多样性与丰富度降低，不利于番茄植株根际微环境土壤健康与植株抗逆(病)能力的提升。

2.3 细菌群落组成分析

1)细菌门分类水平。由图1可知，不同施肥处理番茄植株根际土壤中，细菌门分类水平组成的占比大于1%的优势细菌主要由10个菌门组成，分别是变形菌门 (Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门 (Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、己科河菌门(Rokubacteria)、Patescibacteria和硝化螺旋菌门(Nitrospirae)，占比小于1.0%的非优势菌门的分类归属于其他(Other)门类。此外，虽然不同施肥处理番茄根际土壤中，优势细菌门分类组成相同，但不同施肥处理条件下，相同菌门分类占比表现各异，如：不施肥处理中，变形菌门 (Proteobacteria)细菌的占比为33.5%，单一的氮肥、饼肥和不同配比氮肥/饼肥处理中的占比分别为19.47%、22.29%、21.29%、26.42%和22.46%，不同施肥处理改变了番茄植株根际土壤中优势细菌门分类水平组成的占比(图1)。

图1 不同施肥处理下根际土壤细菌门分类水平组成分布Fig.1 The distribution of soil bacterial community structure in rhizosphere at phylum level

同样地，不同施肥处理条件下，番茄植株根系内生细菌门分类水平主要由变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)组成(图2)。

但不同施肥处理显著影响了番茄植株根系优势内生细菌门分类水平组成。其中，单一的氮肥处理，占比大于1%的根系优势内生细菌门分类组成由不施肥处理的4个优势菌门锐减至2个菌门，仅由变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)组成；单一花生饼肥处理则仅剩变形菌门(Proteobacteria)1种优势菌门；氮肥/饼肥不同配比处理中，随着配比中氮肥比例降低、花生饼肥比例提高，番茄植株根系中，变形菌门(Proteobacteria)内生细菌的占比逐渐提高，放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)细菌占比逐步降低(图2)。

图2 不同施肥处理下根系内生细菌门分类水平结构分布Fig.2 The distribution of endophytic bacterial community structure in root at phylum level

2)细菌属分类水平。由图3可知，不同施肥处理条件下，番茄植株根际土壤中的优势细菌属由norank_c__subgroup_6、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)等15个优势菌属组成(表4)。其中，norank_c__subgroup_6、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、norank_o__Gaiellales、norank_f__Roseiflexaceae、黄色杆菌属(norank_f__Xanthobacteraceae)、芽孢杆菌属(Bacillus)、Gaiella等7个细菌属是不同施肥处理条件下番茄植株根际土壤中的共有优势菌属。此外，norank_c__KD4-96是不施肥处理番茄植株根际土壤中的特有优势菌属；norank_f__JG30-KF-CM45是单一氮肥处理及氮肥高配比(75%)处理中的特有优势菌属；微杆菌属(Microbacterium)细菌则是氮肥高配比(75%)和单一饼肥处理中的特有优势菌属；RB41是单一饼肥处理的特有优势菌属；而芽孢八叠球菌属 (Sporosarcina)则是低氮素配比(25%)饼肥处理中的特有优势菌属。结果表明：不同施肥处理不仅改变了番茄根际土壤中优势细菌属组成的占比，而且还改变了番茄根际土壤中的优势细菌属组成。

图3 根际土壤细菌属分类水平结构分布图Fig.3 The distribution of soil bacterial community structure in rhizosphere at genus level

表4 根际土壤优势细菌属分类水平的组成占比Table 4 The proportion of dominant soil bacteria in rhizosphere at genus level

同样地,不同施肥处理不仅改变了番茄植株根系内生细菌优势菌属的占比，而且亦改变了优势菌属组成(图4)。

图4 根系内生细菌属分类水平结构分布Fig.4 The distribution of endophytic bacterial community structure in root at genus level

与不施肥处理(A)相比，单一的氮肥处理导致假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘脂菌属(Sphingobium)以及泛菌属(Pantoea)等7种优势菌属缺失；单一的饼肥处理(F)同样导致了克雷伯氏菌属 (Klebsiella)等8种优势菌属缺失；氮肥/饼肥配施处理虽然拥有与不施肥处理相同数量的优势内生菌属，但种类发生了明显变化。与不施肥处理相比，高氮肥(75%)/饼肥配比的处理(C)中，缺失了青枯菌属(Ralstonia)、泛菌属(Pantoea)、微杆菌属(Microbacterium)、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、塔特姆菌属(Tatumella)等优势细菌，但富集了艾德昂菌属(Ideonella)、游动放线菌属(Actinoplanes)、norank_f__Moraxellaceae、unclassified_f__Rhizobiaceae、芽孢杆菌属 (Bacillus)等优势细菌属；50%氮肥和50%饼肥配比处理(D)中，则缺失了不施肥处理的泛菌属、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium和塔特姆菌属 (Tatumella)细菌，但同样富集了艾德昂菌属(Ideonella)、游动放线菌属(Actinoplanes)和Lechevalieria属细菌；而25%氮肥和75%饼肥配比处理(E)中，缺失了不施肥处理中的微杆菌属(Microbacterium)、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium和塔特姆菌属(Tatumella)细菌，同时富集了艾德昂菌属(Ideonella)、norank_f__Moraxellaceae和疣孢菌属(Verrucosispora)细菌。综上，不同施肥处理同样改变了番茄植株根系内生细菌的群落结构，单一的氮肥或饼肥处理不仅不利于提高番茄植株根系内生细菌群落的多样性和丰富度，而且还导致部分优势内生细菌属缺失，从而降低了植株的抗性(表5)。

表5 根系优势内生细菌属分类水平的组成占比Table 5 The proportion of dominant endophytic bacteria in root at genus level

3)属分类水平Venn图。单一的氮肥或饼肥处理以及不同氮肥/饼肥配比处理番茄植株根际土壤中，细菌属分类水平数量均高于相应的不施肥处理，但不同施肥处理无助于提高番茄植株根际土壤中的特有细菌属分类水平数量；与不施肥处理相比，仅单一施用氮肥处理特有细菌属数量与不施肥处理持平，均为9个，单一的饼肥处理以及不同氮肥/饼肥配比施肥均导致番茄植株根际土壤中特有的细菌属分类水平数量下降(图5-1)。

另一方面，不同施肥处理亦改变了番茄植株根系内生细菌属分类水平数量。与不施肥处理相比，单一的氮肥和饼肥处理均导致了番茄植株根系内生细菌属分类水平数量的下降，分别由不施肥处理的241下降至184和101，且缺乏特有的细菌属(图5-2)。不同氮肥/饼肥配比施肥则有助于提高番茄植株根系内生细菌属分类水平数量，尤其以50%氮肥和50%饼肥配比的处理提升效果最佳；但随着饼肥比例的增加，至饼肥比例达75%时，与不施肥处理相比属分类水平数量基本一致。但氮肥/饼肥配施均不同程度地提高了番茄植株根系内生细菌特有的细菌属分类水平数量。研究结果表明：氮肥/饼肥配施不仅有助于提高番茄植株根系内生细菌属分类水平数量，尤其有利于增加植株根系特有的内生细菌属数量，从而增强了植株抵御外界环境或病害胁迫的能力。

1.根际土壤细菌 Soil bacteria in rhizosphere; 2.根系内生细菌 Endophytic bacteria in root.图5 根际土壤细菌、根系内生细菌属分类水平Venn图Fig.5 Venn diagram of the soil bacteria in rhizosphere and endophytic bacteria in root at genus level

3 讨 论

土壤细菌作为土壤微生物群落中最大的类群，其占比高达70%～90%，是承担维护土壤健康与土壤肥力以及促进植物吸收土壤养分的重要角色之一[25]。植物内生细菌则是植物微生态系统的重要组成部分，其在植物不同器官分布数量存在差异。其中，根系内生细菌群落结构易受环境因素影响[26]。

本研究中施肥处理不仅改变了番茄植株根际土壤细菌和根系内生细菌不同分类水平数量，而且氮肥/饼肥配施对根际土壤细菌和根系内生细菌不同分类水平的影响总体上呈提升效果；但单一的氮肥或饼肥处理，虽然提高了番茄植株根际土壤细菌不同分类水平数量，但整体上均导致根系内生细菌不同分类水平数量下降。这一结果与赵力光等[27]和靳晓拓等[28]研究化肥减量配施有机肥对土壤细菌多样性和丰富度影响的结果类似。

门分类水平上，变形菌门 (Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门 (Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、己科河菌门(Rokubacteria)、Patescibacteria和硝化螺旋菌门(Nitrospirae)是不同施肥处理番茄植株根际土壤中的优势细菌门分类。但相同优势细菌门分类占比在不同施肥处理中表现各异。这一结果表明，基于门分类水平，施肥处理对番茄植株根际土壤中的细菌群落结构并无显著影响，仅仅改变了根际土壤细菌群落组成的占比；与之相比，施肥处理则显著改变了番茄植株根系内生细菌群落组成，尤其单一的氮肥或饼肥处理，根系优势内生细菌群落组成由不施肥处理的4个优势细菌门类锐减至2个；但有机/无机(氮肥/饼肥)配施处理则没有发生单一化肥或有机肥处理相同的现象，仅发生优势细菌门类组成占比的变化。这一现象表明：单一的化肥或有机肥施用处理，容易引起番茄植株内生细菌群落结构失衡，存在导致植株抗性减弱的可能性。

属分类水平上，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、Gaiella、norank_c__subgroup_6、norank_o__Gaiel上lales、norank_f__Roseiflexaceae、黄色杆菌属(norank_f__Xanthobacteraceae)、芽孢杆菌属(Bacillus)等7个细菌属是不同施肥处理条件下番茄植株根际土壤中的共有优势菌属，但不同施肥处理番茄植株根际土壤中，与不施肥处理相比，仅高比例的饼肥和单一的饼肥处理植株根际土壤中存在特有的优势细菌属：芽孢八叠球菌属(Sporosarcina)和RB41；这一结果表明，施用有机肥更有助于富集土著细菌以外的细菌属，与化肥相比更有助于改变土壤细菌群落结构。另一方面，不同施肥处理亦改变了番茄植株根系内生细菌的群落结构；单一的氮肥或饼肥处理不仅无助于提高番茄植株根系内生细菌群落的多样性和丰富度，而且导致部分优势内生细菌属缺失、青枯菌属细菌富集成为番茄植株内生细菌的优势菌属。已有研究证实青枯菌属(Ralstonia)中的茄劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)是引起番茄青枯病的病原菌[29]，表明施用单一的氮肥或饼肥均不利于番茄植株根系内生细菌群落结构平衡，容易引起植株抗性降低甚至出现病害危害症状。与之相比，氮肥/饼肥配施则不同程度地富集了假单胞菌属 (Pseudomonas)和芽孢杆菌属 (Bacillus)等有益细菌成为番茄植株根系的优势内生细菌属。

综上，施肥处理对番茄植株根际土壤细菌的多样性与丰富度有显著影响；与单一地施用氮肥或饼肥处理相比，氮肥/饼肥配施更有利于改良番茄植株根际土壤微环境，更有助于提高番茄植株的抗性；施用单一的氮肥或饼肥处理，不仅导致番茄植株根际土壤或内生细菌多样性与丰富度降低，而且还导致拟杆菌门(Bacteroidetes)厚壁菌门(Firmicutes)、假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘脂菌属(Sphingobium)、泛菌属(Pantoea)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)等根际土壤和根系内生细菌中，部分优势细菌门、属缺失，同时富集了青枯菌属等病原细菌。单一的氮肥和饼肥施用处理均不利于改良番茄植株根际土壤微环境和提高番茄植株抗性，25%氮肥和75%饼肥配比是改良番茄植株根际土壤微环境及提高植株抗性的最佳配比。