家族性腺瘤息肉病家系的APC基因突变筛查

林 锐，孔祥东，李晓丽

1)郑州大学第一附属医院消化内科 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院遗传与产前诊断中心 郑州 450052 3)郑州大学第一附属医院老年病科 郑州 450052

家族性腺瘤息肉病(familial adenomatous polyposis,FAP)主要特征表现为结直肠布满大小的腺瘤，息肉多于青少年期出现，少数在幼儿时期开始生长，婴儿时期未见生长。息肉数量初起时不多，而后随着年龄增长而增多[1-3]。FAP全球发病率为1/10 000～1/7 000，是一种高度外显的常染色体显性家族性肿瘤综合征，外显率近100%，具有易复发和易癌变的特征，常恶变为结直肠癌，与腺瘤性结肠息肉(adenomatouspolyposis coli,APC)基因突变有关[4]。APC基因的种系突变是导致FAP最常见的原因，APC基因定位于染色体5q21～5q22，含16个外显子(其中第一外显子不编码)，编码具有8个亚结构的APC蛋白。APC蛋白参与细胞周期的调控、凋亡、黏附迁移、信号转导等过程，通过负性调控WNT/细连环蛋白通路抑制结直肠肿瘤发生[5-6]。第15外显子突变最为多见，可长达6 574 bp，超过98%的突变是框移突变和无义突变，最终导致截短蛋白的产生。本研究采用高通量测序技术对4个FAP家系进行了突变筛查，报道如下。

1 对象与方法

1.1研究对象收集2017年4月至2019年11月就诊于郑州大学第一附属医院遗传与产前诊断中心并进行基因检测的4个FAP患者，男、女各2例，年龄29～35岁。所有患者进行直肠指检、体格检查，血常规、粪便隐血试验、肿瘤标志物CEA及CA19-9检测，CT/MRI影像学检查，直肠镜、电子结肠镜+病理活检均符合FAP诊断标准。依据《遗传学结直肠癌临床诊治和家系管理中国专家共识》[7]，FAP的诊断标准：结直肠内弥漫性息肉数量≥100个或者腺瘤性息肉数量<100个并伴有家族史或者先天性视网膜色素上皮肥厚。从该院遗传与产前诊断中心DNA库中随机挑选200名健康对照，对照均排除肿瘤及全身疾病。研究对象均签署知情同意书，本研究获得该院医学伦理委员会批准(KS-2018-KY-36)。

1.2FAP基因突变检测

1.2.1 基因组DNA提取 抽取患者外周静脉血2 mL，乙二胺四乙酸二钾抗凝，通过磁珠法提取试剂盒(美国Omega Bio-tek公司)和自动化DNA提取设备(艾本德中国有限公司)提取样本DNA，采用超微量分光光度计(GE Healthcare公司)测定DNA的浓度和纯度，DNA浓度均大于30 mg/L，A260 nm/280 nm达1.8～2.0。

1.2.2 高通量测序和数据分析 结直肠癌相关基因panel(包括MUTYH、BMPR1A、PTEN、POLE、BLM、GREM1、TP53、SMAD4、STK11、POLD1、EPCAM、MSH2、MSH6、CHEK2、MLH1、APC、PMS2、GALNT12)在Ion torrent PGM高通量测序平台(美国Thermo Fisher Scientific公司)靶向扩增并进行文库构建，制备模板并富集纯化，加入测序引物和聚合酶后，在芯片上样，通过Ion PGM扩二代测序(Sequencing 200 kit v2)试剂盒进行大规模平行测序。通过Ion Torrent Suite 4.0.2软件处理分析高通量测序数据，用序列比对插件、coverage分析插件、varrentcaller插件进行进一步分析；在Ion reporter软件上参考人类基因组版本hg19(https://ionreporter.1ifetechnologies.com/ir/)进行变异注释。

1.2.3 Sanger测序验证 参考Ensembl数据库基因序列，应用Gene Tool软件设计APC基因第15外显子的引物，由上海生工生物有限公司合成(引物序列见表1)。纯化PCR产物后采用ABI BigDye Terminator v3.1试剂盒测序，在ABI 3130XL 基因测序仪上进行直接双向测序，最后用Chromas软件分析测序数据，寻找变异位点。

表1 APC基因外显子引物序列

1.3突变命名及致病性判定通过dbSNP、1000G、ExAC和PubMed等公共数据库对目标变异位点进行检索，未在人类基因变异数据库(human gene mutation database,HGMD)专业版记录中记录同时也未被公共数据库和学术论文报道过的变异可视为新变异。新突变的命名参考国际基因突变命名体制(http://www.hgvs.org/mutnomen)的命名法命名；参照美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)指南，评判突变位点的致病性。

2 结果

2.1临床分析4个FAP家系中4名先证者的家系图谱见图1,临床资料见表2。

□：正常表型男性；○：正常表型女性；■：男性患者；●：女性患者；箭头所指为先证者

表2 FAP家系先证者一般情况

2.2FAP基因突变检测结果家系1：先证者携带APC基因c.4348C>T(p.Arg1450Ter)[8]杂合变异，该变异为无义变异(图2A)，导致APC蛋白翻译提前终止，使APC蛋白含量减少或功能缺陷，HGMD专业版数据库已报道其与FAP相关。结合先证者病史及家族肿瘤史，初步判定先证者的临床表型为APC基因突变所致。

家系2：先证者携带APC基因c.3629_3630delAT(p.Met1211Valfs*5)杂合变异(图2B)，该变异在正常人群中的频率为零，为低频变异，未见相关致病性报道，为新发现突变，根据Mutation Taster软件及ACMG指南，初步判定该变异为疑似致病变异。结合先证者病史及家族肿瘤史，初步判定先证者的临床表型为APC基因突变所致。

家系3：先证者携带APC基因c.4384_4385delAA(p.Lys1462Glufs*6)[9]杂合变异(图2C)，该变异为低频变异，HGMD专业版数据库已报道其与FAP相关，根据Mutation Taster软件及ACMG指南，初步判定该变异为疑似致病变异。家系分析显示，先证者母亲因肠癌去世无法追踪突变来源，先证者妹妹同样携带该变异，先证者父亲该位点无突变。结合该家系的家族史，推测已故先证者母亲为该突变导致的肠癌患者的可能性极大。

家系4：先证者携带APC基因c.3594_3595delAA(p.Lys1199Glufs*8)杂合变异(图2D)，该变异为低频变异，未见相关致病性报道，为新发现突变，根据Mutation Taster软件及ACMG指南，该变异初步判定为疑似致病变异。家系分析显示，先证者父亲携带该变异，先证者母亲该位点无突变，符合常染色体显性遗传方式及突变-表型共分离规律。

A～D:分别为家系1～4

3 讨论

腺瘤病理检查和内镜下结直肠息肉数目是目前临床诊断FAP的主要依据，但某些消化道息肉疾病如Lynch综合征、Peutz综合征、MYH相关性息肉病、幼年性息肉综合征、遗传性非息肉性结肠直肠癌等与FAP难以区别，这使明确临床诊断困难。因此，通过基因测序技术进行分子诊断可以辅助临床及早准确地进行诊断和治疗。本研究利用高通量测序技术对FAP家系进行了全外显子组检测分析，具有耗时短、成本低、数据量足等优点，检测结果均经Sanger测序验证。

有研究[9-10]报道西方人群中APC基因突变类型与临床表型相关，突变密集区位于密码子第1 027～1 354位，其中第1 061和1 309位密码子的5 bp缺失是突变热点，该突变导致的病变出现时间早、表型严重。第9外显子、密码子1～157位和1 595～2 843位的突变与轻型FAP相关(息肉小于100枚)[11]。本研究中，4例患者APC基因突变均发生在第15外显子，与已有报道相同。

本研究中，4个家系检出的APC基因分别为c.4348C>T(p.Arg1450Ter)、c.3629_3630delAT(p.Met1211Valfs*5)、c.4384_4385delAA(p.Lys1462Glufs*6)、c.3594_3595del(p.S1198fs)4个变异，均是位于第15外显子的无义突变和框移突变，均可导致终止密码子提前出现编码截短蛋白，截短蛋白的出现可造成β连环蛋白进入细胞核增多进而导致多种癌基因表达，其中c.3629_3630delAT(p.Met1211Valfs*5)和c.3594_3595del(p.S1198fs)变异均为未报道过的变异。

本研究不仅拓展了FAP致病基因变异谱，而且为理解该病的分子病理机制提供了重要信息，对该病的准确诊断、家系的遗传咨询具有指导意义。针对这样的家系应详细询问家族史，当家族成员中有相似表型时，及时进行结肠镜检查同时结合基因检测，及早监测携带突变而尚无临床表型的家庭成员，以预防结直肠癌变。

随着FAP临床表型与APC基因相关性认知的深入研究和进展，临床工作者可利用更先进的遗传筛查技术更早、更准确地对患者进行诊断和治疗，基因检测结果可与临床诊断相辅相成。此外，无家族史的FAP群体筛查也应受到重视，对于群体筛查，高通量测序也是一种适宜的技术。