蒙药古日古木-13含药血清对过氧化氢诱导的人Huh-7细胞损伤的保护作用

吴敏超，李 璇，段伟娜，张海峰＊

（内蒙古医科大学基础医学院，内蒙古 呼和浩特 010059）

20世纪80年代末日本学者Hiroko Iwama提出的“血清药理学方法”被认为是中药研究的新突破。“含药血清”是指定时定量给动物服用药物之后，经过一定时间后采血，离心后得到的血清。与其他方法相比，含药血清可以较好地反映复合药物的有效作用成分及作用环境。含药血清因其独特的优势，而被众多科研人员所采用，并进行了深入的探索与研究[1，2]。氧化应激是由于抗氧化剂系统和活性氧（ROS）生产速率不平衡所引起的。适量水平的ROS在正常细胞生理中很重要，但是过量ROS引起的氧化应激超出生理需要可能会干扰正常过程[3~5]。氧化应激是多种肝损伤发病的重要机制，氧化应激参与炎症、代谢和纤维化性肝病的过程，并与病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、肝纤维化、肝癌所致的肝损伤密切相关[6]。古日古木-13是一种蒙药传统方剂。由红花、木香、栀子、麝香、麦冬、川楝子、牛黄、诃子、银朱、紫檀香、水牛角、丁香及莲子等十三味药材配制而成。目前，蒙医领域已经广泛应用古日古木-13[7]。邬国栋、郭叶等人曾采用HPLC法，以栀子苷为内参物，建立没食子酸、羟基红花黄色素A、鞣花酸、木香烃内酯、去氢木香内酯的相对校正因子，计算古日古木-13样品中该6种成分的含量[8]，但却未曾有人检测蒙药古日古木-13含药血清的有效成分，本研究选用过氧化氢（H2O2）诱导Huh-7肝癌细胞氧化应激损伤模型，研究蒙药古日古木-13的抗氧化作用及其保护机制，为深入研究其在多种肝病治疗上的应用提供重要基础数据。

1 实验细胞与实验动物及主要药品

本研究选用实验动物为250g的健康SD大鼠SCXK（蒙）2016-0001，雄性，SPF级，购于内蒙古大学实验动物研究中心。Huh-7人肝癌细胞购于北京北纳创联生物技术有限公司。蒙药古日古木-13（水丸）内蒙古蒙药股份有限公司，硫普罗宁肠溶片上海凯宝新宜药业有限公司，3%过氧化氢试剂Sigma。

2 实验方法

2.1 H2O2致肝癌细胞损伤模型的建立

取对数生长期细胞，细胞数约为1×104，均匀细胞悬液至96孔板，于培养箱孵育24 h；加H2O2培养1 h。加10μL CCK8试剂，于培养箱孵育90 min，测其OD值，计算细胞抑制率及IC50（半数抑制率）[9，10]。

2.2 蒙药古日古木-13含药血清及含药血清培养基的制备

将SD大鼠40只，分为蒙药高、中、低剂量组、PBS组（PBS＋1%土温80）。适应性喂养7天后灌胃，灌胃前12 h禁食。连续灌胃7天，于最后一次灌胃后1 h心脏取血。离心，滤器过滤，56℃灭活。含药血清、双抗、DMEM基础培养基按1：0.1：9比例配置完全培养基。4℃冰箱保存。

2.3 蒙药古日古木-13含药血清最适浓度的选取

将细胞分为空白血清组、H2O2＋空白血清组、H2O2＋阳性血清组、H2O2＋古13血清组，均匀接种96孔板，37℃、5%CO2培养箱孵育过夜；弃去原培养液，加入100μL含药血清培养基，37℃、5%CO2培养箱孵育6h、12h、18h、24h。加H2O2，培养箱孵育1 h。加10μL CCK8试剂，于培养箱孵育90 min，测其OD值。计算细胞增殖率，选取最适浓度组。

2.4 HPLC法检测血清中有效成分含量

如上述2.2步骤制备含药血清，3000 r/min，离心15 min，吸取血清。取100μL血清加入300μL色谱甲醇，混匀后12000 r/min离心3 min，吸取上清，参考邬国栋、郭叶等人研究[8]，采用HPLC法，计算古日古木-13样品中有效成分。

2.5 Huh-7细胞凋亡率

接种对数生长期的Huh-7细胞于6孔板。培养箱孵育至贴壁生长；弃去培养液，加入含药血清培养基，培养箱孵育18 h。加H2O2培养1 h。吸取6孔板内上清，加到6个离心管内（终止胰酶作用），PBS冲洗6孔板3次，加入胰酶消化2 min，收集6孔板内细胞，标号按顺序加入之前的6个离心管内，离心，弃上清。加入200μL结合液，吹打重悬细胞，加入5μL FITC染液，5μL PI染液，轻轻混匀。避光孵育10~20 min，室温放置，等待上机检测。其间每管又加300μL结合液，过400目细胞筛于流式上样管中。流式细胞仪上机检测。

2.6 qPCR法检测NF-κB的表达水平

种对数生长期的Huh-7细胞于6孔板，培养箱孵育至贴壁生长；弃去培养液，加入含药血清培养基，培养箱孵育18 h。加过氧化氢，孵育1 h后，用Trizol提取总RNA。

表2 引物序列

2.7 细胞总蛋白提取及蛋白印迹法测蛋白表达量

种对数生长期的Huh-7细胞于6孔板，培养箱孵育至贴壁生长；弃去培养液，加入含药血清培养基，培养箱孵育18 h。加入H2O2，37℃，5%CO2，孵育1 h。弃去培养液，用冷PBS冲洗2遍，加入100μL预冷含PMSF的蛋白质裂解液，离心取上清，加上样缓冲液，将蛋白放入沸水中煮10 min。加样、电泳、恒流转膜。5%脱脂奶粉封闭1 h后，放入一抗盒中孵育，4℃过夜。TBST冲洗10 min，重复3遍。常温孵育二抗1 h。TBST洗膜3次。显色。

2.8 统计分析

采用Graphpad Prism 8统计软件分析，数据资料采用表示，两两比较采用取LSD-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同浓度H2O2损伤Huh-7细胞后细胞存活率的变化

通过CCK8法及IC50公式可知，肝细胞生存率随着H2O2浓度升高而降低（见图1）。Huh-7细胞半数致死率为930 mmol/mL。H2O2诱导的肝细胞氧化应激损伤模型制备成功。

3.2 不同浓度含药血清对H2O2损伤Huh-7细胞的保护作用

不同浓度的古13含药血清对H2O2诱导肝细胞氧化应激损伤模型均有作用，其中中剂量浓度古13含药血清，效果最明显（P<0.05），作为后续作用条件。古13含药血清孵育人Huh-7细胞6 h、12 h及24 h的保护作用无统计学意义。孵育18 h后，中剂量古13含药血清对H2O2诱导人Huh-7细胞损伤有显著的保护作用（P＜0.05）（见图2）。

图1 不同浓度H2O2损伤Huh-7细胞后细胞存活率的变化

3.3 液相色谱分析图分析

通过分析液相色谱分析图（见图3~6），含药血清主要成分是没食子酸及鞣花酸。

图2 不同浓度含药血清对H2O2损伤Huh-7细胞的保护作用

图3 没食子酸一级结构

图5 鞣花酸酸一级结构

图6 鞣花酸二级碎片

为没食子酸（C7H6O5）标准品及蒙药含药血清待测品，tR/MIN为3.27，其[M-H]-为169.01314，二级碎片为109.06577（见图3）；为鞣花酸（C14H6O8）标准品及蒙药含药血清待测品，tR/MIN为11.82，其[M-H]-为300.99789，二级碎片为245.0307（见图5）。由此可知蒙药含药血清主要成分是没食子酸及鞣花酸，其中以鞣花酸为主。

3.4 H2O2损伤的Huh-7细胞后凋亡率变化

通过流式细胞仪检测细胞凋亡，H2O2诱导Huh-7肝细胞损伤模型成功，即H2O2＋10%空白血清组作用的肝细胞凋亡率（62.50%±1.322%）高于10%空白血清组作用的肝细胞凋亡率（6.443%±1.075%）（P＜0.05），H2O2＋10%古13血清组作用的Huh-7肝细胞凋亡率（53.36%±0.7428%）小于H2O2＋10%空白血清组作用的肝细胞凋亡率（P＜0.05），差异有统计学意义（见图7）。

图7 H2O2损伤的Huh-7细胞后凋亡率变化

通过荧光定量PCR技术，各血清组分别作用Huh-7细胞18 h，与10%空白血清组NF-κB mRNA相比，H2O2＋10%空白血清组NF-κB mRNA表达量升高，表明造模成功；与H2O2＋10%空白血清组NF-κB mRNA表达量相比，H2O2＋10%阳性血清组及H2O2＋10%古13血清组表达量明显降低（P＜0.05）（见图8）。

图8 H2O2损伤的Huh-7细胞NF-κB表达量的变化

3.6 H2O2损伤的Huh-7细胞的NF-κB蛋白表达变化统计

通过蛋白质印迹法检测NF-κB蛋白表达量，Image J软件分析目的蛋白显影灰度值与内参蛋白灰度值的比值，可得出如下结论（见图9）：各血清组分别作用Huh-7细胞18 h，与10%空白血清组NF-κB蛋白相比，H2O2＋10%空白血清组NF-κB蛋白表达量升高，证明造模成功；与H2O2＋10%空白血清组NF-κB蛋白表达量相比，H2O2＋10%阳性血清组蛋白表达量及H2O2＋10%古13血清组蛋白表达量明显降低（P＜0.05）。

图9 H2O2损伤的Huh-7细胞的NF-κB蛋白表达变化统计图

4 讨论

蒙药古日古木-13已广泛应用于肝脏疾病的治疗，还可与其他蒙药联合应用治疗多种疾病[11~13]。经本课题组前期研究证明，蒙药古日古木-13对小鼠肝部分切除术诱导的肝损伤有明显的保护作用。但其是否对氧化应激损伤的肝细胞有保护作用，鲜有报道，为此本课题设计了该实验。本文选取不同浓度的H2O2作用于人Huh-7细胞，造成细胞损伤，使细胞活性降低，通过CCK-8试剂检测人Huh-7细胞在H2O2不同浓度损伤的作用下，细胞存活率。通过IC50公式计算细胞半抑制率，结果显示当Huh-7细胞抑制率为50%时，H2O2的浓度为930 μmol/L时。故后续实验采取此浓度建立细胞损伤模型。

邬国栋、郭叶等人曾采用HPLC法，检测出古日古木-13样品中6种成分的含量，未有报道显示检测蒙药古日古木-13含药血清有效成分，本课题组，通过HPLC法，以栀子苷为内参物，检测到蒙药古日古木-13含药血清的有效成分是没食子酸及鞣花酸。其中鞣花酸占比较高。鞣花酸是一种天然多酚类植物化学物的衍生物，具有抗氧化、抗癌、抗动脉粥样硬化、抗炎、抗菌和抗毒性等作用[14]。文献证明，鞣花酸所含的羟基能明显增强其抗氧化损伤的能力，在口服吸收后0.5~1.0h内血清中鞣花酸浓度达到峰值[15]。蒙药古日古木-13含药血清含有大量鞣花酸，因此蒙药古日古木-13含药血清对过氧化氢诱导人Huh-7细胞有明显保护作用。

为实验进一步研究蒙药古日古木-13含药血清对过氧化氢诱导人Huh-7细胞的保护作用。将大鼠随机分为PBS空白组、古日古木-13低、中、高剂量组，灌胃7天，于末次灌胃后1 h心脏取血。制备蒙药古日古木-13含药血清。通过CCK-8试剂检测不同浓度的蒙药古日古木-13含药血清提前6 h、12 h、18 h、24 h加入细胞培养基中作用Huh-7细胞，细胞存活率，分析蒙药古日古木-13含药血清作用的最佳时间及最佳浓度。结果显示，当提前18 h加入蒙药古日古木-13中剂量含药血清培养基时，其保护作用最佳。

细胞凋亡是有核细胞通过启动自身内部的遗传机制激活内源性DNA内切酶而发生的一种主动细胞死亡过程。通过流式细胞仪检测发现，蒙药古日古木-13含药血清作用过氧化氢损伤的Huh-7细胞后，细胞凋亡率明显下降。

氧化应激损伤是最常见的应激损伤，是细胞中ROS水平超过细胞抗氧化能力的一种状态，也是肝损伤发生机制中的重要损伤机制和环节。氧化应激反应常引起NF-κB信号通路表达。NF-κB是一种多效性的核转录因子，可调控多种基因的表达，这些基因也可促进各种肿瘤细胞的生长、存活和转化。NF-κB转录因子是中央协调宿主防御者对压力，伤害和感染的反应调节剂。本课题通过逆转录酶定量聚合酶链反应（qPCR）实验可知，蒙药古日古木-13含药血清中剂量组NF-κB表达量较模型组NF-κB表达量明显下降（P＜0.05）。说明古13含药血清中剂量组对过氧化氢诱导人Huh-7细胞损伤有保护作用，其机制可能与NF-κB通路有关。