盐预适应对鲁氏酵母菌高盐胁迫抗性的影响

王定康，张 良，邹江鹏，车经纬，李 丹，金 垚，周荣清，吴重德,*

(1.四川大学 轻工科学与工程学院， 四川 成都 610065；2.泸州老窖集团有限责任公司， 四川 泸州 646000)

鲁氏酵母菌(Zygosaccharomycesrouxii)因具有产醇、产香、增鲜等重要功能，被广泛应用于豆瓣、酱油等传统发酵食品的生产过程中[1-2]。由于这些发酵食品常常在高渗透压环境下生产，鲁氏酵母菌不可避免的会经受盐胁迫、酸胁迫和氧胁迫等[3]。近年来，鲁氏酵母菌抵抗胁迫的能力已得到国内外研究者的广泛关注，但对进一步提高鲁氏酵母菌的胁迫抗性的策略及其机理还缺乏完整的认识。

预适应处理作为一种提高微生物胁迫抗性的策略[4]，通过使细胞预先暴露于亚致死的胁迫条件下，随后细胞会表现出对相同或不同应激因子更高的抵抗力[5]。酸适应性反应机制(acid tolerance responses, ATR)是常见的预适应保护机制。何桂强等[6]考察了嗜盐四联球菌经过pH值为4.5的酸预适应处理60 min后，再经过pH值为2.5的酸致死胁迫60 min，其存活率比未经预适应处理的细胞显著提高。Hartke等[7]研究表明，乳酸乳球菌乳亚种细胞在pH值为5.5的酸预适应处理30 min后，可显著提高酸致死胁迫(pH值为3.9)的存活率。除了酸预适应处理外，有关热预适应处理和冷预适应处理也有报道。Broadbent等[8]研究发现，嗜酸乳杆菌NCFM、干酪乳杆菌LC301和瑞士乳杆菌LH212分别在50、42、52 ℃预适应处理20 min后，再分别经受63、54、63 ℃致死胁迫时，与未经预适应处理的细胞相比，细胞存活率分别提高到处理前的27、5、11倍。Cheng等[9]研究表明，生防酵母菌经过40 ℃预适应处理30 min，可以提高其对盐胁迫(175.5 g/L NaCl)耐受性。Mitchell等[10]揭示了酿酒酵母菌经过轻度的热胁迫或酒精胁迫处理后，可提高其抵御强氧化应激的能力。酸、热、冷等预适应处理的方法已有部分研究报道，但有关盐预适应处理提高细胞抗逆性能的策略及机制方面的研究鲜有报道。

本研究以鲁氏酵母菌为研究对象，拟用盐预适应处理的策略提高鲁氏酵母菌高盐胁迫抗性，并对预适应后细胞生理特性进行解析，希望为筛选高活性的鲁氏酵母菌及其在传统食品发酵生产中的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲁氏酵母菌(ZygosaccharomycesrouxiiCGMCC 3791)，本实验室从百年老字号酿造企业(四川省郫县豆瓣股份有限公司)的豆瓣酱本醅中分离获得，并经过26S rDNA和ITS区域序列测序、鉴定、命名，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心。超微量Na+/K+- ATPase试剂盒，南京建成生物公司；4-羟乙基哌嗪乙磺酸- 醋酸钾(HEPES- KAc)细胞裂解缓冲液，北京雷根生物公司；2′,7′-二(羧乙基)- 4或5-羧基荧光素、二乙酰甲酯(BCECF AM)荧光探针，北京百奥莱博科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

SW- CJ- 2FD型超净工作台，苏州净化设备有限公司；TU- 1901型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；GL- 20G- Ⅱ型高速冷冻离心机，上海安亨科学仪器厂；92- IIN型超声波破碎粉碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；JJ500型分析天平，常熟双杰测试仪器厂；Trace GC Ultra- DSQII型气相色谱- 质谱联用仪，美国赛默飞世尔科技公司；A300型氨基酸分析仪，德国默曼博尔公司。

1.3 实验方法

1.3.1盐胁迫实验

分别取20 mL对数生长中期的鲁氏酵母菌细胞，离心(10 000g、4 ℃、5 min)，洗涤后重悬于不同质量浓度(0、60、120、180、350 g/L)NaCl的YPD培养基中，30 ℃处理90 min，收集菌体并洗涤两次，进行菌落计数。

1.3.2盐预适应处理和盐胁迫实验

选取合适的盐预适应浓度范围和细胞致死盐浓度，进行后续盐预适应和盐胁迫实验。细胞分别在不同质量浓度(0、60、120、180 g/L)NaCl的YPD培养基中，30 ℃处理90 min；再重悬于350 g/L NaCl的YPD培养基中，30 ℃处理90 min。收集菌体并洗涤两次，进行菌落计数。选取较佳的盐预适应浓度条件，进行后续细胞生理指标测定。

1.3.3盐预适应处理对细胞生理影响的指标测定

1.3.3.1 胞内pH值的测定

参考文献[11]的方法：取20 mL培养液离心(8 000g、4 ℃、5 min)，收集菌体，用50 mmol/L HEPES- KAc (pH值8.0)缓冲液洗涤2次，重悬于等体积的相同缓冲液中；加入1 μL BCECF AM荧光探针，30 ℃温水浴20 min；用50 mmol/L磷酸盐缓冲液 (pH值7.0)洗涤3次，重悬于等体积的该缓冲液中。根据文献[12-13]所述方法，用荧光分光光度计测定菌悬液荧光强度(Itotal)和上清液荧光强度(Ifiltrate)，其中激发波长为488 nm和440 nm，发射波长为535 nm，狭缝宽度均为5 nm。荧光强度的计算方法见式(1)。

I=[(I490)total-(I490)flitrate]/[(I440)total-(I440)flitrate]，

(1)

再根据lgI的值由标准曲线计算胞内pH值。

1.3.3.2 Na+/K+- ATPase活力的测定

取20 mL培养液离心(8 000g、4 ℃、5 min)，收集菌体。将菌体重悬于1 mL 50 mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH值7.0)中，冰浴超声(工作3 s，间歇2 s，全程25 min，功率400 W，保持温度4 ℃)。用超微量Na+/K+- ATPase活力测定试剂盒检测Na+/K+- ATPase活力。采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，以牛血清白蛋白为标准蛋白进行计算。Na+/K+- ATPase活力以单位标准蛋白中含有的Na+/K+- ATPase酶活力表示，U/mg。

1.3.3.3 细胞膜脂肪酸的提取和测定

取20 mL培养液离心(8 000g、4 ℃、5 min)，收集菌体。参照Wu等[14]的方法提取细胞膜脂肪酸和制备脂肪酸甲酯，用0.22 μm滤膜过滤。采用气相色谱- 质谱联用仪对样品进行测定，测定条件参照Zheng等[15]的方法进行，由峰面积计算脂肪酸的相对含量。脂肪酸不饱和度和平均碳链长度的计算方法见式(2)和式(3)。

(2)

(3)

式(2)中，UFAP为不饱和脂肪酸占总脂肪酸的比例，%；SFAP为饱和脂肪酸占总脂肪酸的比例，%。式(3)中，FAP为单个脂肪酸占总脂肪酸的比例，%；C为脂肪酸碳原子数。

1.3.3.4 胞内氨基酸含量的测定

取20 mL培养液离心(8 000g, 4 ℃, 5 min)，收集菌体。将菌体重悬于1 mL 50 mmol/L的PBS (pH值7.0) 缓冲液中，置于沸水中15 min，离心(8 000g、4 ℃、5 min)，取上清液。添加100 μL质量分数为10%的磺基水杨酸沉淀蛋白，用0.22 μm滤膜过滤，随后参照Cui等[16]的方法，用氨基酸分析仪测定游离氨基酸的含量。

1.4 数据处理

所有数据均为3次重复实验的平均值。采用软件SPSS 19.0对数据进行统计学分析，以 One-way ANOVA 进行显著性检验，并采用ORIGIN 8.5对数据绘图。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫处理对鲁氏酵母菌存活率的影响

本研究团队前期已对鲁氏酵母菌在不同NaCl浓度下生长曲线进行了测定，当培养基中未添加NaCl时，与添加了NaCl的溶液相比，Z.rouxii的生物量更高[17-18]。本研究为筛选合适的盐预适应条件，考察了鲁氏酵母菌在不同NaCl浓度下处理90 min的存活率变化，实验结果见图1。由图1可知，以未添加NaCl处理90 min，细胞存活率为100%计算，细胞在60、120、180 g/L的NaCl和饱和NaCl质量浓度(350 g/L)下处理90 min，存活率分别为96.37%、80.49%、43.67%和19.04%；因此，选取60～180 g/L NaCl质量浓度为盐预适应浓度范围，350 g/L NaCl质量浓度为高盐胁迫条件，进行后续盐预适应处理对高盐胁迫耐受性能的考察。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图1 不同浓度NaCl胁迫处理对Z. rouxii 存活率的影响Fig.1 Effects of stress treatment with different NaCl contents on survival rate of Z. rouxii

2.2 盐预适应对鲁氏酵母菌高盐胁迫耐受性的影响

考察了不同浓度NaCl预适应处理对鲁氏酵母菌高盐胁迫下存活倍数的影响，实验结果见图2。由图2可知，以未经盐预适应直接进行高盐胁迫(350 g/L，90 min)的细胞存活倍数为1计算，经过60、120、180 g/L的NaCl预适应前处理90 min，细胞存活倍数分别提高到处理前的2.06、2.53、1.92倍，可见盐预适应处理可提高细胞的高盐胁迫耐受性；质量浓度为120 g/L的NaCl预适应处理效果最为明显，选取该条件作为最佳预适应处理条件。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图2 不同浓度NaCl预适应处理对鲁氏酵母菌高盐 胁迫下存活倍数的影响Fig.2 Effects of NaCl preadaptation on survival fold of Z. rouxii stressed with high salinity stress

2.3 盐预适应对鲁氏酵母菌生理特性的影响

2.3.1盐预适应对胞内pH值的影响

本研究为探究盐预适应处理提高鲁氏酵母菌细胞耐盐性的机制，对盐预适应处理前后细胞生理特性变化进行了分析。首先考察了鲁氏酵母菌在盐预适应前后，以及盐胁迫过程中胞内pH值的变化，实验结果见图3。由图3可知，预适应前的细胞(before preadaptation, BP)胞内pH值为6.11，细胞直接经过盐胁迫(salt stress, SS)后，胞内pH值急剧下降至4.83；当经过质量浓度为120 g/L的NaCl预适应90 min后(salt preadaptation, SP)，细胞的胞内pH值为5.31，并且经过盐预适应处理的细胞，再进行盐胁迫处理(salt preadaptation to salt stress, SP- SS)，胞内pH值为5.10。因此，盐胁迫导致了胞内pH水平显著降低，而经过盐预适应处理后的细胞再经盐胁迫，比未经盐预适应直接进行盐胁迫的细胞保持了更高的胞内pH值。有研究表明，细胞的胞内pH值与细胞生长、细胞黏附、细胞内吞有关，胞内pH值的降低伴随着细胞生长活性的减弱[19]，可见盐预适应处理可以帮助细胞维持胞内pH值的相对稳定，从而提高细胞对盐胁迫的耐受性。

BP—预适应前；SP—盐预适应处理后；SS—直接高盐胁迫；SP- SS—先经盐预适应再高盐胁迫。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图3 盐预适应对鲁氏酵母菌胞内pH值的影响Fig.3 Effects of salt preadaptation on intracellular pH value of Z. rouxii

2.3.2盐预适应对Na+/K+-ATPase活力的影响

Na+/K+- ATPase是公认的评价细胞盐适应能力的生物标志物，在许多生理过程中起着关键作用，包括转运营养物质、调节渗透压、调节细胞体积等[20-21]。本研究测定了盐预适应对鲁氏酵母菌胞内Na+/K+- ATPase活力的影响，实验结果见图4。由图4可知，细胞经过盐预适应(SP)后，Na+/K+- ATPase活力由预适应前(BP)的0.708 U/mg上升到1.081 U/mg，并且经过盐预适应前处理的细胞，在盐胁迫过程中(SP- SS)的Na+/K+- ATPase活力(1.087 U/mg)显著高于未经预适应直接进入盐胁迫(SS)的细胞(0.651 U/mg)。由细胞膜上的离子梯度产生的膜电位是多种细胞内活动的基础，而Na+/K+- ATPase可维持细胞内最佳的Na+和K+梯度[22]。Petrezs等[23]证实了酿酒酵母菌可上调表达Na+/K+- ATPase的活力来抵御高盐胁迫。本研究结果表明，盐预适应处理有助于提高胞内Na+/K+- ATPase活力，从而增强了细胞盐胁迫耐受性。

BP—预适应前；SP—盐预适应处理后；SS—直接高盐胁迫；SP- SS—先经盐预适应再高盐胁迫。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图4 盐预适应对鲁氏酵母菌胞内Na+/K+- ATPase 活力的影响Fig.4 Effects of salt preadaptation on intracellular Na+/K+- ATPase activity of Z. rouxii

2.3.3盐预适应对细胞膜脂肪酸组成的影响

研究了预适应对盐胁迫条件下细胞膜脂肪酸组成的影响，实验结果见图5。由图5可知，与未经预处理(BP)的细胞相比，盐预适应(SP)处理导致细胞膜饱和脂肪酸(棕榈酸C16:0，硬脂酸C18:0)的相对含量分别减少至处理前的93%和79%，不饱和脂肪酸(棕榈油酸C16:1，油酸C18:1和亚油酸C18:2)的相对含量分别增加到处理前的1.93和1.61倍。值得注意的是，盐胁迫后，与未经盐预适应直接盐胁迫(SS)的细胞相比，先经过盐预适应(SP- SS)的细胞，其棕榈酸C16:0和硬脂酸C18:0的相对含量分别减少至93%和60%，而棕榈油酸C16:1、油酸C18:1和亚油酸C18:2的相对含量分别增加到处理前的2.55、1.78、1.39倍。在酿酒酵母菌中也发现了相似的现象，Guo等[24]研究表明，酿酒酵母菌在酸胁迫后，其棕榈酸C16:0的相对含量降低，油酸C18:1的相对含量升高，并且过量表达编码去饱和酶的基因OLE1，会提高油酸C18:1的相对含量，脂肪酸不饱和指数也会增加，导致酿酒酵母菌耐酸性能显著提高。

BP—预适应前；SP—盐预适应处理后；SS—直接高盐胁迫；SP- SS—先经盐预适应再高盐胁迫。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图5 盐预适应对鲁氏酵母菌细胞膜脂肪酸组成的影响Fig.5 Effects of salt preadaptation on changes of membrane fatty acids proportion of Z. rouxii

分析了细胞膜脂肪酸的不饱和度和平均碳链长度的变化，实验结果见图6。由图6可知，经过盐预适应(SP)的细胞与预适应前相比(BP)，其不饱和度增加到处理前的1.93倍，并且先经过盐预适应前处理的细胞(SP- SS)，在盐胁迫条件下，其不饱和度是未经盐预适应直接盐胁迫(SS)细胞的2.28倍。细胞膜脂肪酸平均碳链长度分析表明，盐胁迫后(SS)的细胞比盐胁迫前(BP)的细胞平均链长略有增加，但SP- SS细胞与SS细胞无显著差异。研究表明，在不利的酿造环境中，脂肪酸对酿酒酵母的细胞膜和细胞整体代谢活力起着重要的维持作用[25]，脂肪酸不饱和指数的增加，会有助于细胞抵抗盐胁迫[26-27]。这种现象的原因是含有较高比例不饱和脂肪酸的膜结构松散，流动性更强，有利于抵御渗透胁迫[28]。由此可见，预适应处理能够帮助细胞调节膜脂肪酸的组成，提高不饱和脂肪酸的比例，从而增强细胞耐受高盐浓度的能力。

BP—预适应前；SP—盐预适应处理后；SS—直接高盐胁迫，平均碳键长度以碳原子数表示。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图6 盐预适应对鲁氏酵母菌盐胁迫条件下细胞膜 脂肪酸不饱和度和平均碳链长度的影响Fig.6 Effects of salt preadaptation on changes of unsaturation degree and mean chain length of Z. rouxii during salt stress

BP—预适应前；SP—盐预适应处理后；SS—直接高盐胁迫；SP- SS—先经盐预适应再高盐胁迫。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图7 盐预适应对鲁氏酵母菌盐胁迫条件下胞内 氨基酸含量的影响Fig.7 Effects of salt preadaptation on changes of intracellular amino acids contents of Z. rouxii during salt stress

2.3.4盐预适应对胞内氨基酸含量的影响

氨基酸作为细胞内重要的相容性溶质，可平衡细胞内外的渗透压，增强细胞抵抗外界的胁迫能力[29-30]。本研究测定了在预适应和盐胁迫过程中细胞内氨基酸含量的变化，实验结果见图7。由图7可知，当细胞经过盐预适应(SP)后，有3种氨基酸[脯氨酸(Pro)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)]的含量比预适应前(BP)增加，4种氨基酸[缬氨酸(Val)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)和赖氨酸(Lys)]的含量降低；当比较经过盐预适应前处理的细胞(SP- SS)和无预适应直接盐胁迫的细胞(SS)胞内氨基酸含量时，发现丝氨酸、苏氨酸和赖氨酸的含量更高。研究表明，鲁氏酵母菌可通过提高编码半胱氨酸裂合酶和苏氨酸合成酶基因的表达水平，使胞内积累一定量的半胱氨酸和苏氨酸来抵御盐胁迫[17]。由此可见，盐预适应处理可帮助细胞在高盐胁迫条件下保持胞内氨基酸的水平，从而更有利于细胞的存活。

3 结 论

研究了盐预适应对鲁氏酵母菌高盐胁迫抗性的影响。先后考察了盐胁迫对鲁氏酵母菌存活率的影响，以及盐预适应对鲁氏酵母菌耐受高盐胁迫抗性的影响，并从胞内微环境(胞内pH水平、Na+/K+- ATPase活力、胞内氨基酸含量)和细胞膜脂肪酸组成的角度解析了细胞在盐预适应过程以及盐胁迫条件下的生理特性变化。结果表明：经过120 g/L NaCl处理90 min，细胞的耐盐性最为明显；当比较先经盐预适应再高盐胁迫细胞与直接高盐胁迫的细胞时，发现细胞内pH值和Na+/K+- ATPase活力更高，并且先经盐预适应再高盐胁迫细胞具有相对含量更低的饱和脂肪酸(棕榈酸C16:0，细胞内硬脂酸C18:0)和更高的不饱和脂肪酸(棕榈油酸C16:1，油酸C18:1，亚油酸C18:2)，从而具有更高细胞膜脂肪酸的不饱和度；而胞内氨基酸丝氨酸、苏氨酸和赖氨酸的含量也更高。希望本研究结果可以为进一步理解预适应保护鲁氏酵母菌抗逆的生理机制，为高活性鲁氏酵母菌的制备和工业应用提供理论参考。