抗N-甲基-D-天冬氨酸受体脑炎患者脑脊液细胞学特点分析

刘慧勤 任海涛 高鑫雅 赵燕环 范思远 时英英 李玮 张杰文 关鸿志

抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)脑炎是一可治的自身免疫性疾病，其特征是抗体介导的NMDAR丢失，导致神经精神症状呈进行性恶化，包括精神障碍、记忆缺陷、癫痫发作、运动障碍、不自主运动、意识减退及自主神经功能障碍等[1-2]。脑脊液细胞学检查是一诊断中枢神经系统感染、炎性脱髓鞘、肿瘤性及出血性疾病的实用方法，与脑脊液常规检查比较，它不仅能提供炎症程度的信息，而且在评价细胞形态方面更具优势[3]。目前有关抗NMDAR脑炎患者脑脊液检查特点，尤其是脑脊液细胞学检查特点的研究较少。该研究通过分析抗NMDAR脑炎患者脑脊液检查结果，旨在探讨抗NMDAR脑炎的脑脊液细胞学特点及临床意义。

1 对象和方法

1.1 对象收集2015-01-01—2018-12-31河南省人民医院及北京协和医院收治的抗NMDAR脑炎患者164例，其中河南省人民医院69例，北京协和医院95例。患者均符合2017年中华医学会神经病学分会颁布的《中国自身免疫性脑炎诊治专家共识》抗NMDAR脑炎确诊标准[4]，且基于CBA法检测脑脊液抗NMDAR抗体阳性，并排除神经系统感染性疾病、神经系统原发肿瘤或转移瘤、腰椎穿刺术穿刺损伤者。

1.2 方法

1.2.1资料收集：一般资料包括性别、年龄、起病至就诊时间、是否患有肿瘤、肿瘤类型、首次发病/复发病程及神经功能评分。神经功能评分用改良Rankin量表(modified Rankin scale，mRS)于腰椎穿刺当天进行评定。脑脊液检查包括脑脊液常规、生化、细胞学、抗NMDAR抗体滴度及寡克隆区带结果。所有脑脊液数据均来源于急性发作期或复发期。如患者接受多次腰椎穿刺，仅收集第一次的脑脊液结果。

1.2.2抗NMDAR抗体检测：患者均行脑脊液抗NMDAR抗体检测，采用CBA法。试剂为德国欧蒙医学实验诊断股份公司提供的间接免疫荧光抗谷氨酸受体抗体检测试剂盒(批号：FA 111m-1005-3)，操作按照试剂盒说明书进行。脑脊液抗NMDAR抗体滴度分为1∶1或1∶10、1∶32、1∶100、≥1∶320。

1.2.3脑脊液细胞学检查：采用脑脊液细胞学沉淀室(自然沉淀法)制片。取0.5 mL脑脊液加入脑脊液沉淀室，置于4℃冰箱中过夜，待细胞自然沉淀并干燥后，采用迈-格-姬(May-Grun-wald-Giemsa，MGG)染色法[3]染色，置光镜下观察细胞形态、分类及数量。依据镜下细胞计数及形态，将炎性反应程度分为4级：(1)正常：细胞数≤200个/0.5 mL且未见炎性反应细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、激活淋巴细胞、激活单核细胞、浆细胞)；(2)轻度：细胞数≤200个/0.5 mL但可见炎性反应细胞，或细胞数201～500个/0.5 mL；(3)中度：细胞数501～2000个/0.5 mL；(4)重度：细胞数>2000个/mL。依据镜下细胞形态及分类将炎症类型分为：(1)淋巴细胞性炎性反应；(2)淋巴细胞+中性粒细胞性炎性反应；(3)淋巴细胞+中性粒细胞+嗜酸性粒细胞性炎性反应。并观察有无激活淋巴细胞及浆细胞等。

1.2.4脑脊液一般检查：包括颅内压测定、脑脊液常规细胞计数、脑脊液生化及寡克隆区带。颅内压>180 mmH2O界定为高颅压，脑脊液常规细胞数增高定义为白细胞数>5×106/L，且无红细胞增多，脑脊液常规白细胞数<5×106/L界定为脑脊液常规细胞数正常，脑脊液蛋白升高定义为>0.45 g/L，脑脊液检出而对应血清未检出的寡克隆区带定义为特异性寡克隆区带阳性。

1.3 统计学处理采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，非正态分布的计量资料采用中位数(四分位数间距)表示；计数资料采用例或率表示，采用卡方检验；神经严重程度与脑脊液检查的相关性，以及脑脊液常规检查与细胞学检查间的相关性采用Spearman相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料164例患者中，女性94例，男性70例，女∶男=1.34∶1；年龄2～65岁，平均(25.85±12.62)岁。首次就诊患者139例(84.8%)，复发就诊患者25例(15.2%)，起病至就诊时间中位数为30 d，四分位数间距为45 d，mRS评分中位数为4分，四分位数间距为2分。18例女性发现畸胎瘤，1例女性发现胸腺瘤，1例男性发现小细胞肺癌，出现神经症状均早于肿瘤发现时间。

2.2 抗NMDAR抗体滴度164例患者均行脑脊液抗NMDAR抗体检测，抗体均呈阳性，其中142例接受抗体滴度评价，其中滴度为1∶1或1∶10的患者24例(16.9%)，1∶32者59例(41.5%)，1∶100 者54例(38.0%)，≥1∶320者5例(3.5%)。

2.3 脑脊液细胞学164例患者均行脑脊液细胞学检查，均可见淋巴细胞和单核细胞。检测到中性粒细胞者23例(14.0%)，可见激活淋巴细胞者51例(31.1%)，可见浆细胞者16(9.8%)例。112例(68.3%)可见炎性反应，其中轻度炎性反应46例(28.0%)，中度炎性反应58例(35.4%)，重度炎性反应8例(4.9%)。炎性反应类型为淋巴细胞性炎性反应89例(54.3%)，淋巴细胞+中性粒细胞混合性炎性反应22例(13.4%)。中性粒细胞比例为1%～80%，其中中性粒细胞比例<10%者11例，10%～50% 8例，>50%者3例。1例患者为淋巴细胞+中性粒细胞+嗜酸性粒细胞混合性炎性反应，中性粒细胞比例为3%，嗜酸性粒细胞比例为2%。抗NMDAR脑炎患者脑脊液细胞学典型表现见图1。

注：NMDAR：N-甲基-D-天冬氨酸受体，表1～3同；A、B：淋巴细胞性炎性反应；C、D：淋巴细胞+中性粒细胞性炎性反应；红色箭头示淋巴细胞；黄色箭头示浆细胞；黑色箭头示中性粒细胞

2.4 脑脊液一般检查颅内压升高者占37.0%(54/146)例。164例患者均行脑脊液常规、生化检查。脑脊液白细胞中位数10×106/L，四分位数间距32×106/L，其中105例(64%)白细胞数升高，白细胞中位数为25×106/L，四分位数间距53.0×106/L，白细胞数在(6～10)×106/L、(11～100)×106/L、>100×106/L的患者分别为26例(15.9%)、71例(43.3%)、8(4.9%)例。蛋白水平中位数0.36 g/L，四分位数间距0.26 g/L，其中54例蛋白升高，蛋白水平为(0.45～1.00)、(1.00～1.50)、>1.50 g/L的患者分别为43例(26.2%)、8例(4.9%)、3例(1.8%)。葡萄糖水平平均为(3.46±0.88)mmol/L，其中葡萄糖减低9例(5.5%)。氯为(123.46±4.49)mmol/L，氯减低23例(14.0%)。111例行寡克隆区带检查，其中特异性寡克隆区带阳性51例(45.9%)。

2.5 脑脊液常规与脑脊液细胞学的相关性Spearman相关性分析显示，164例抗NMDAR脑炎患者脑脊常规检查白细胞计数与脑脊液细胞学白细胞计数呈正相关(r=0.630，P<0.01)，脑脊液常规检查白细胞分级与细胞学炎性程度分级呈正相关(r=0.592，P<0.01)。

2.6 神经功能严重程度与脑脊液参数的相关性分析Spearman相关性分析显示抗NMDAR脑炎患者mRS评分与脑脊液抗NMDAR抗体滴度呈正相关(r=0.357，P<0.01)，而与脑脊液常规检查白细胞计数、脑脊液常规检查白细胞分级、脑脊液细胞学白细胞计数、细胞学炎性程度分级无相关性(表1)。

表1 164例抗NMDAR脑炎患者mRS评分与脑脊液检查的Spearman相关性分析

2.7 脑脊液细胞学浆细胞与寡克隆区带的关系脑脊液细胞学浆细胞阳性与否与寡克隆区带阳性与否间无统计学相关性(表2)。

表2 抗NMDAR脑炎患者脑脊液细胞学浆细胞与特异性寡克隆区带的关系

2.8 脑脊液常规细胞数正常患者脑脊液细胞学与mRS评分的关系脑脊液常规细胞数正常患者共59例，其中26例(44.1%)脑脊液细胞学显示有炎性反应，33例脑脊液细胞学正常。mRS评分与脑脊液细胞学白细胞计数、炎性程度分级呈正相关(r=0.259，P=0.047；r=0.264，P=0.043)。脑脊液细胞学显示有炎性反应的患者mRS评分更重(χ2=5.544，P=0.019)。结果见表3。

表3 脑脊液常规细胞数正常抗NMDAR脑炎患者不同脑脊液细胞学结果组间mRS评分分布〔n(%)〕

3 讨论

脑脊液常规、生化检测是疑诊脑炎患者的基本初筛检查手段。该研究显示，抗NMDAR脑炎患者脑脊液常规多表现为轻至中度的白细胞增高，少数可>100×106/L；脑脊液蛋白多正常或轻度升高；大部分患者脑脊液糖、氯正常，少数呈轻度减低。这与既往研究结果相似[1，5-6]。脑脊液白细胞、蛋白平均水平明显低于细菌感染性疾病，与病毒引起的中枢神经系统感染相似。少部分患者脑脊液细胞数明显增高，细胞学呈现淋巴与中性粒细胞混合性炎性反应，与结核、真菌等感染性疾病表现类似，此时正常或轻度异常的脑脊液蛋白、葡萄糖、氯水平有助于鉴别。

脑脊液细胞学检查是诊断中枢神经系统感染、炎性脱髓鞘、肿瘤性及出血性疾病的实用技术。相较于脑脊液常规，它不仅能提供炎性反应程度的信息，在评价细胞形态学方面更具优势[3]。该研究显示，抗NMDAR脑炎脑脊液细胞学以淋巴细胞性炎症为主，部分患者可见淋巴与中性粒细胞混合性炎症，亦可见激活淋巴细胞及浆细胞。这些特点有助于对抗NMDAR脑炎机制的认识。抗NMDAR脑炎免疫机制主要为体液免疫，淋巴细胞及浆细胞在其免疫过程中至关重要。在B细胞活化因子的作用下，记忆型B细胞到达大脑，经抗原刺激、亲和力成熟、克隆扩增等，分化为产生抗NMDAR抗体的浆细胞[7-9]。脑脊液中的 CD19+B 细胞和CD138+CD19+浆细胞是鞘内合成免疫球蛋白的主要来源[10]。该研究中脑脊液细胞学可见浆细胞及部分患者特异性寡克隆区带阳性为抗NMDAR抗体在鞘内合成提供了有力证据。T淋巴细胞在抗NMDAR脑炎的免疫过程中亦发挥重要作用。Th17细胞、Th1细胞可有效辅助生发中心外的B细胞反应，促进抗体生成[11]。此外，该研究还发现部分抗NMDAR脑炎患者的脑脊液中可见中性粒细胞。中性粒细胞在抗NMDAR脑炎中的作用尚不明确，但中性粒细胞亦见于视神经脊髓炎谱系疾病患者的脑脊液细胞学[12]。在水通道蛋白4抗体的作用下补体激活，大量的中性粒细胞通过中性粒细胞弹性蛋白酶依赖机制进入中枢神经系统，参与视神经脊髓炎病灶的发生[13-14]。由此作者推测中性粒细胞参与抗NMDAR脑炎的免疫过程，但具体机制尚需进一步探讨。

该研究结果显示，抗NMDAR脑炎患者脑脊液细胞学白细胞计数与脑脊液常规白细胞计数、脑脊液细胞学炎性程度分级与脑脊液常规白细胞分级有良好的相关性，提示脑脊液细胞学可为评估脑脊液炎性程度提供可靠信息。此外，该研究结果亦显示，在急性发作期36%的患者脑脊液常规白细胞计数正常，这与既往报道的约15%～96%的抗NMDAR脑炎患者在第一次检测时脑脊液常规无炎症反应的结论一致[15]。脑脊液常规无炎症反应不能排除抗NMDAR脑炎的诊断，这部分患者极易被误诊，造成免疫治疗迟滞。亚组分析结果显示，44.1%的脑脊液常规正常患者脑脊液细胞学可见炎性反应，且这部分患者的神经功能残障程度更重，表明对于脑脊液常规正常的抗NMDAR脑炎患者，脑脊液细胞学可作为检测炎性反应的重要手段。

mRS评分是评价脑炎患者神经功能严重程度的可靠、简便工具[1，16-17]。该研究结果显示脑脊液抗NMDAR抗体滴度与mRS评分呈正相关。这与Gresa-Arribas等[17]研究结果一致。此外，该研究还发现对于脑脊液常规阴性的患者，脑脊液细胞学白细胞计数及炎性程度分级与mRS评分呈正相关，表明除脑脊液抗NMDAR抗体滴度可作为评估神经功能严重程度的工具外，对于脑脊液常规阴性的患者，脑脊液细胞学白细胞计数、炎性程度分级也可作为评估神经功能受损严重程度的实验室指标。

综上所述，该研究结果显示，约2/3的抗NMDAR抗体脑炎患者脑脊液细胞学可见炎性反应，淋巴细胞性炎性反应是最常见的炎性反应类型，中性粒细胞可见于部分患者，嗜酸性粒细胞少见。激活淋巴细胞、浆细胞、特异性寡克隆区带可见于部分患者。脑脊液细胞学可检测到部分脑脊液常规未显示的炎性状态，这部分患者的神经功能残障程度相对更重。脑脊液细胞学具有发现脑脊液常规阴性者炎性反应的检测能力及评价抗NMDAR脑炎患者神经功能严重程度的价值，可作为评估抗NMDAR脑炎的重要方法。