利用流式细胞术检测甜菜染色体倍性和DNAC-值

沙 红，高 燕，董心久，高卫时，玛依拉·玉素音，杨洪泽

(新疆农业科学院经济作物研究所，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】甜菜(Beta.vulgarisL.)属于藜科(Chenopodiaceae)甜菜属(BetaL.)，2年生经济作物，是我国北方重要的产糖原料[1]。我国甜菜种质多样，主要有糖用、饲用、直接食用。糖用甜菜栽培品种多为在二倍体或四倍体，在育种过程中也会出现单倍体、三倍体，但是甜菜多倍体品种较二倍体品种具有更强的杂种优势。目前，我国糖用甜菜已进入广泛应用多倍体杂种优势阶段，生产上广泛应用的品种以三倍体杂交种为主[2]。在利用手中资源选育品种时，及时、准确了解掌握材料的倍性，有利于加快选育进程、提高选育目标性。流式细胞术(flow, cytometry, FCM)是一种能够对群体细胞进行单细胞水平的多个参数同时快速定量分析和分选的技术，其在农业领域的应用还有较大的发展空间[3]。流式细胞技术可以精准地对鞘液中的荧光微粒进行数据统计，快速、准确、简便地检测待测植物的倍性与细胞核DNA含量，并且非常适用于大样本的检测分析，是近年用来检测染色体倍性的常用方法[4-6]。倍性水平的分析、鉴定对于植物分类及育种具有重要意义[5]。研究流式细胞术检测甜菜染色体倍性和DNAC-值，对甜菜染色体倍性、分子生物学领域相关研究有实际意义。【前人研究进展】传统的倍性鉴定多采用根尖、茎尖或花粉粒直接进行染色体计数来判断倍性，传统染色体倍性鉴定技术需要专业技术人员具有相当熟练的操作技能，过程复杂，耗时多[7，8]。李盛贤[9]在1988年报道过以扫描显微光密度测定法对甜菜植株和种子有生殖力的多倍性进行测定。董立[10]研究了甜菜染色体镜检的具体方法。鲁文英[11]、魏良民[12]等利用甜菜叶片保卫细胞中叶绿体个数或观察气孔性状来判断甜菜的倍性。但用甜菜叶片保卫细胞中叶绿体个数或观察气孔性状鉴定在糖用甜菜、饲用甜菜表现不一样，判断二倍体、四倍体的标准也不同，在材料选择时容易混乱。同时测试材料取样条件会受环境、植株自身状态的影响。这些间接办法过程复杂，耗时长，准确性低。目前随着科学技术的飞速发展，流式细胞仪的使用越来越普及，采用流式细胞仪有效克服上述缺点，能快速、简单、准确的测定甜菜种质的倍性，尤其是在早期快速高效地鉴定、筛选出目标倍性水平植株材料已用于相关育种应用[13]。【本研究切入点】目前国内尚无关于利用流式细胞术鉴定甜菜染色体倍性和DNAC-值的检测方法的研究报道。研究利用流式细胞仪测定分析不同倍性甜菜的染色体。【拟解决的关键问题】以二倍体M39-8-4嫩叶为材料，以已知基因组的新疆野杏洛浦洪待克为外标，建立适合于甜菜染色体倍性和基因组的流式细胞术测定方法，为甜菜的基因组学、细胞生物学和种质资源研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

甜菜品种： M39-8-4超原 (二倍体)，02343刘福齐(二倍体)，7208 伊抗褐(四倍体)，需鉴定材料LSR88-5-1(二倍体或四倍体)均由新疆农业科学院经济作物研究所甜菜育种研究室提供。

1.2 方 法

1.2.1 解离液及 DNA 荧光染料的配制

配制细胞核解离液，所有解离液均需用真空泵抽滤(0.22 μm 滤膜)，去除大的颗粒、细菌等。预先配好的解离液均于4℃保存。核酸荧光染料是能插入双链的碘化丙啶(propidium iodide, PI)，用于装备488 nm激光 。在解离液中PI染液的终浓度50 μg/mL。并在PI 染液中加入适量 RNA 酶，排除RNA 的干扰。PI染液配制方法参照田新民[14]。表1

表1 常用细胞核解离液配方[5，7]

1.2.2 细胞核悬浮液的制备

避开主叶脉的选取叶片1.5～2 cm2，用蒸馏水冲洗2～3遍，再用去离子水冲洗2～3遍，滤纸吸干后放在清洗好的预冷培养皿中，加入解离液1.5 mL。将培养皿放在平整的冰袋上用刀片垂直、快速切碎后用200目滤膜过滤到1.5 mL离心管中， 4℃下孵育5～10 min，4℃1 000 r/min离心5 min，吸取上清弃之，在管中保留100 μL，再加入100 μL预冷的解离液。加入150 μL预冷的PI染料，轻轻混匀，在4℃下孵育10 min，上机待测。每个样本获得约250 μL细胞悬浮液。

1.2.3 上机检测

流式细胞仪型号为 AccuriC6 (BD, 美国), 蓝色激光488 nm激发，接受通道为波长范围在585/40 nm的FL2的荧光。每个样本做3次平行试验，每次至少收集1×104个颗粒。变异系数控制在5%以内。

1.3 数据处理

FCM通过记录样品的 G1/G0 和G2/M 期细胞的荧光强度，反应基于对照和样品的G1/G0峰的荧光强度值来计算 2C DNA 含量。所有植物的单倍体 DNA含量，也以质量值pg和Mb (1 pg=978 Mb)计算。未知样品的倍性水平和 DNA 含量计算如下：待测样本DNA含量(pg/Mb)=对照样本 DNA 含量×(待测样品 G0/G1 峰荧光均值)/(对照样品G0/G1峰荧光均值)[7]。使用Cytometer software workspace 软件直接读取变异系数的、进行DNA 含量和倍性数据进行相应分析。用Excel 2016 对数据做相关分析。

2 结果与分析

2.1 细胞核解离液的筛选

研究表明，用WPB解离液所制备的悬浮液上样后不能形成峰值 ，其无法将甜菜嫩叶中细胞核完整释放出来，收集细胞数少。Galbraith's、GP、LB01 、HEPES、MgSO4解离液有完整的峰，但峰幅较宽，在峰左右两侧出现背景碎片，有干扰峰出现。Marie's解离液制备甜菜嫩叶的细胞核解离液上样后能形成左右对称主峰，峰幅窄，CV值都在5%以下，上样速率超过 200 events/μL，可重复性好，结果清晰、可靠。图1

图1 检测甜菜倍性及 DNA 含量

2.2 检测甜菜倍性

A、B分别是已确定倍性的M39-8-4超原(二倍体)和7208伊抗褐(四倍体)2份材料。二倍体材料M39-8-4超原，CV值为1.94%小于5% ，G0/G1峰值的均值为295 175.98，数据可靠；已知四倍体7208伊抗褐，CV值为 1.69%，G0/G1 峰值的均值为631 946.40，数据可靠。7208伊抗褐的荧光通导值约为M39-8-4超原的2倍，且CV值均小于5%，可以认为用Marie's作为流式细胞术的解离液检测甜菜样本倍体是可行的。待测材料 LSR88-5-1的G0/G1 峰值的均值为295 390.29，CV值为 1.52%，与二倍体材料M39-8-4超原的值很接近，荧光通导值约为四倍体7208伊抗褐的一半，LSR88-5-1材料为二倍体材料。表2，图2

注：A:M39-8-4超原; B:7208 伊抗褐; C:LSR88-5-1；D：洛浦洪待克

2.3 检测甜菜DNA值

以新疆野杏洛浦洪待克为外标，分别测定二倍体甜菜悬浮液和新疆野杏洛浦洪待克悬浮液的荧光强度为300 000左右，新疆野杏洛浦洪待克荧光强度为110 000。研究表明，二倍体M39-8-4超原、02343刘福齐和LSR88-5-1的均值分别是295 175、320 335和295 390，DNA含量分别是821.88 Mb、 891.94 Mb和822.48 Mb。四倍体7208伊抗褐均值631 946， DNA含量1 759.59 Mb，是二倍体材料的约2倍。表2

表2 利用流式细胞仪检测甜菜倍性及DNA含量

3 讨 论

FCM是通过流式细胞分析仪对大量处于分裂间期的细胞核内DNA含量进行检测，经仪器附设的计算机软件统计分析，最后绘制出含量倍性的分布曲线图，进而推断细胞的倍性[4-6]。具体是用G1期的DNA含量间接反映染色体倍性水平。用FCM一般可同时获得植物细胞核DNA含量和倍性的数据。自1983年Galbraith运用FCM测定了17种植物的细胞核DNA含量，流式细胞术越来越多利用在测定植物DNA含量和倍性上，如新疆野杏[7]、苜蓿[8]、梨树[15]、枣和酸枣[16、17]、樱属[18]、鼠尾草[19]、草莓[20]等多种作物上开展。

流失细胞术测定的细胞必须处于单细胞悬浮液状态，该技术关键在制备细胞核悬浮液和核酸荧光染色。如果细胞悬浮液制作不成功，会与未染色的阴性对照没有显著差别。不同植物的组织结构和化学成分存在较大差异，不同细胞核提取缓冲液及酶解液对植物的提取效果也不相同，大量研究报道表明，目前还没有一种通用的植物细胞核解离液[5]。如报道中WPB解离液更多用在木本植物上，但新疆野杏并不适用[7]。在不同物种应用FCM时，需要适当改变缓冲液成分，从而获得较高分辨率、提高结果的可靠性、稳定性和可重复性。如果想要FCM检测甜菜倍性和DNA含量，筛选适合甜菜幼嫩叶片的细胞核解离液十分必要。常用于木本植物解离液WPB完全不适合，没有峰形成。使用 Galbraith's、GP、LB01 、HEPES、MgSO4核解离液时，可以形成峰，但峰幅较宽，碎片较多，会形成干扰；Marie's细胞核解离液相对效果最好。与已发表其他植物相比，甜菜幼嫩叶片为材料时会多出一个较明显的峰，其原因还需进一步探讨。试验中PI是一种目前相关DNA流式细胞术中普遍的荧光染料，用于装备488 nm激光，能插入双链DNA中。PI具有较高的分辨率及较低的毒性。这类染料除了能与双链DNA结合，同样也能与双链RNA结合，在使用时同时加入了适量的RNAase。试验结果表明，加适量RNAase的50 μg/mL PI能作为探针。

在利用FCM时，一般要选着一个已知倍性或DNA-C值得作为参考，确定待测植物的倍性[21、22]。试验用FCM来检测甜菜倍性和DNA含量。通过试验确定了FCM的适用性及其具体操作步骤、细胞核解离液及注意事项方法。因此，在试验时选择了已明确倍性的、纯度高的甜菜品系材料二倍体M39-8-4超原、02343刘福齐和四倍体7208伊抗褐和未知倍性LSR88-5-1的待测材料，同时选择选取二倍体新疆野杏'洛浦洪待克'幼叶为外标。试验结果能很好的区分甜菜二倍体和四倍体材料，数据重复性好、可靠。因试验材料的限制，没对甜菜单倍体、三倍体进行检测。据耿小丽等[6]报道，利用FCM鉴定紫花苜蓿花药愈伤组织的变异时，能清晰的检测出二倍体、三倍体、四倍体以及二倍体加四倍体的嵌合体。利用FCM检测甜菜倍性对今后甜菜育种和遗传学研究应用很有意义。

4 结 论

Marie's是最佳的解离液，测定值变异系数均小于5.0%。甜菜幼嫩叶片可作为进行流式细胞术检测的理想材料，通过FCM检测供试样本可区分甜菜二倍体和四倍体，所测的二倍体DNA含量范围为821～891 Mb/C，四倍体DNA 含量1 759 Mb/C。