利用SSR分子标记技术快速鉴定津甜100甜瓜种子纯度

武云鹏 李肯 张若纬 彭冬秀

摘 要：利用SSR分子标记技术鉴定甜瓜种子纯度，是甜瓜种子生产、销售过程中的关键环节，对甜瓜产业发展具有重要意义。利用津甜100亲本对24对甜瓜SSR引物进行多态性筛选，得到多态性高、在F1代中条带差异较大的2对引物。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对F1群体进行鉴定，鉴定结果与田间鉴定结果一致，纯度均为99.0%。因此， 笔者筛选得到多态性高、条带差异大的2对引物，可鉴定津甜100甜瓜种子。

关键词：甜瓜;分子標记;引物;快速检测

Abstract： Identification of the melon seeds purity by SSR molecular marker technology is the key link in the process of melon seeds production and sales. I24 pairs of SSR primers of oriental melon were used to screen for the polymorphism of Jintan 100 parents， 2 pairs of primers with high polymorphic in F1 generation were obtained. The purity of F1 population was identified by polyacrylamide gel electrophoresis using the 2 pairs， the molecular identification results were consistent with the field identification results， and the purity was 99%. Therefore， two pairs of primers with high polymorphism were screened to identify Jintian 100 oriental melon seeds.

Key words： Melon; Molecular marker; Purity; Rapid detection

甜瓜（Cucumis melo L.）是葫芦科黄瓜属一年生蔓生植物，香甜可口，肉质酥脆多汁，深受消费者喜爱。随着人们生活水平的提高，对高品质甜瓜的需求也逐年增加[1]，因此促进了甜瓜产业的快速发展。众所周知，市场销售的甜瓜种子大多数为杂交种，在甜瓜杂交种商品化繁殖过程中，由于去雄不彻底或人工失误掺入杂种，使得杂交种纯度下降，给种植户造成不可挽回的经济损失，因此也制约了产业的快速发展[2]。当前，对于甜瓜杂交种纯度的鉴定多采用田间形态鉴定，不仅费工、耗时，还易受环境等外界因素的影响，从而降低鉴定结果的可靠性[3]。综上所述，制定一套简单、快速、准确的甜瓜杂交种种子真实性的检测方法，对提高种子质量、降低种子检测成本和缩短检测周期具有重要意义。

近些年来，随着分子生物学技术不断发展， DNA分子标记技术已广泛应用于作物杂交种子纯度鉴定工作中[4]，前人已经将RAPD标记应用于甜瓜品种鉴定中，但多数RAPD标记表现为显性，不能区分杂合子[5]。而SSR标记为共显性标记，对DNA质量要求较低，能很好地区分杂交种与父、母本条带的差异，因此SSR标记可广泛应用于甜瓜杂交种纯度和真实性的鉴定工作中。前人研究结果显示，应用SSR标记技术鉴定甜瓜杂交种真实性主要应用于厚皮甜瓜中，而在薄皮甜瓜中还少有报道[6-9]。因此，笔者利用薄皮甜瓜津甜100杂交种及亲本对24对甜瓜SSR核心引物进行筛选及多态性检测，以期获得一套简单、快速、准确的SSR标记技术体系，用于津甜100甜瓜杂交种种子纯度鉴定。

1 材料和方法

1.1 材料

于2019年在天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所试验基地和实验室进行，试验材料为天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所甜瓜研究室培育的甜瓜杂交种津甜100及其亲本，共计3份薄皮甜瓜材料。3月初温室播种育苗，津甜100播种100株，父、母本各20株，4月初定植于连栋冷棚，平畦地膜覆盖，常规栽培管理。

实验药品为DNA试剂盒（康为），Taq Master Mix（康为），10×TBE（Solarbio），40%丙烯酰胺（Solarbio），TEMED（Solarbio），10×Loading Buffer（宝生物）;24对引物（表1）序列由天津市农业质量标准与检测技术研究所兰青阔老师提供，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 甜瓜亲本DNA提取采用康为DNA试剂盒法，取100 mg新鲜嫩叶加入液氮充分研磨，研磨后立即加入400 μL Buffer LP1和RNase（10 mg?mL）漩涡震荡1 min，室温静置1 min。然后加入130 μL Buffer LP2混匀，漩涡震荡1 min后，12 000 r?min-1离心5 min，将上清液移至新的离心管中。加入1.5倍体积的Buffer LP3充分混匀，将混合液转移至组装的吸附柱中12 000 r?min-1离心1 min，倒掉废液，将吸附柱放回试管中，再向吸附柱加入500 μL Buffer GW2并12 000 r?min-1离心3 min，倒掉废液，将吸附柱静置15 min晾干水分。最后将吸附柱放入新的1.5 mL离心管中，向吸附柱悬空加入100 μL Buffer GE，室温放置5 min，12 000 r?min-1离心1 min，收集DNA溶液-20 ℃保存。

津甜100杂交种DNA提取采用碱煮法，取新鲜嫩叶100 mg于2 mL离心管中，加入钢珠和100 μL NaOH（浓度为0.4 mol?L-1）溶液，在组织破碎仪中研磨粉碎后，将离心管放入沸水中煮1 min，离心后取上清液10 μL加入100 mmol?L-1 Tris缓冲液（pH 8.0）100 μL，混匀待用。

1.2.2 PCR扩增体系 采用王利英等[10-11]PCR反应体系，共10 μL，包括：5 μL Taq Master Mix（康为），2 μL ddH2O，2 μL模板DNA（质量浓度为100 ng?μL-1），上下游引物各0.5 μL（浓度为10 pmol?μL-1）。

PCR扩增程序 94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸30 s;循环34次，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。

1.2.3 电泳及银染检测 采用垂直电泳槽，电泳缓冲液为0.5XTBE，8%（w）非变性聚丙烯酰胺凝胶，电压为150 V电泳2 h后，对凝胶进行银染，步骤为：固定-凝胶浸泡于0.5%冰醋酸（900 mL H2O+100 mL 无水乙醇+5 mL冰醋酸）溶液，摇床轻摇6 min;染色-过滤固定液，加入0.5%硝酸银溶液（1000 mL H2O+2 g AgNO3），轻摇8 min;清洗-过滤染色液，加入蒸馏水清洗30 s;显影-加入显影液（1000 mL H2O+15 g NaOH+3 mL甲醛）摇床轻摇，直至出现清晰条带，加入甲醛时，必须在通风橱内进行;漂洗-过滤显影液，加入蒸馏水轻摇1 min，最后用保鲜膜包好，在灯箱观测结果并拍照记录。

1.2.4 引物筛选及品种鉴定 利用亲本对24对引物进行特异谱带筛选，选出谱带清晰、特异性高的共显性引物，并利用该引物在津甜100的100个单株间进行测试，记录带型表现，最后与田间鉴定结果进行对比。

2 结果与分析

2.1 引物筛选

利用津甜100父、母本对24对引物进行筛选，结果如图1。每对引物占4个条带，父、母本分别占2个条带。从图中可以看出，JT-14、JT-22和JT-24在双亲之间显示出特异性条带。而JT-14和JT-22的条带清晰，双亲差异明显，因此可用于津甜100甜瓜种子纯度鉴定。

2.2 利用共显性标记引物进行津甜100杂种鉴定

利用引物JT-14和JT-22对100株津甜100杂交种进行纯度鉴定，部分单株SSR电泳图谱如图2所示。第30号杂交种表现为母本带型，其余均为双亲互补带型，因此可推算出津甜100杂交种纯度为99.0%。与此同时，对田间种植的杂交种进行田间形态鉴定，发现第30号植株表现为母本性状，其余均为杂交种性状。由此说明，利用分子标记法进行甜瓜种子纯度鉴定结果和田间形态鉴定结果一致。

3 讨论与结论

杂交种纯度和真实性鉴定是蔬菜种子质量监督检测中一个非常重要的检测项目[12]。传统的甜瓜种子纯度主要依赖于田间形态鉴定，鉴定周期长，易受环境和人为主观因素影响，最终结果的准确性不高，从而影响良种及时销售，使种子公司遭受巨大损失。因此，探索一套简易、快速、准确的甜瓜种子纯度鉴定体系，对甜瓜良种的销售具有重要意义。

近年来，随着分子生物学的快速发展，分子标记技术已在甜瓜中广泛应用。DNA指纹图谱已成为准确鉴定品种的有力工具[13]，其中SSR分子标记因操作简便、重复性好、呈共显性标记，已经被广大学者用于种子纯度和真实性检测。姜陆等[14]利用2.5%（w）琼脂糖凝胶技术鉴定西州密17号甜瓜种子纯度，具有制胶简便、检测时间短等优点，常用于DNA样本分析，但是，笔者采用的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳具有成本低、一次性检测样本量大、所用设备相对简单、不使用有毒的荧光染剂等优点，常被广大学者所应用。在种子生产过程中，由于母本去雄不彻底而掺入自交种是杂种的主要来源，但是，由于棚室密封不严，导致昆虫带入外源花粉，也可以产生种间混杂。因此，利用多对引物对杂交种进行鉴定，通过对结果进行校对，能更有效、直观地计算杂交种的纯度，而李超等[15-17]学者利用单一引物鉴定甜瓜种子纯度，有可能因为试验失误导致最终结果不准确。但是，利用多对特异性引物组合进行鉴定仅在西瓜中有少量报道[18]，在甜瓜种子鉴定工作中鲜有报道。因此笔者通过2对特异性引物构建PCR体系，对甜瓜津甜100进行种子纯度鉴定，使鉴定结果更加清晰明确，提高了鉴定的准确性与工作效率。

建立一套简单、快速、准确的SSR标记技术体系，不仅能够验证甜瓜杂交种纯度和真实性，还能为建立甜瓜DUS測试、良种市场监督管理及新品种自主知识产权保护提供技术支撑[19]。

利用津甜100双亲对24对甜瓜引物进行筛选，得到2对在双亲间表现出特异性并且条带清晰、差异明显的引物JT-14和JT-22，并通过8%（w）丙烯酰胺凝胶电泳对100份杂交种进行检测，最终鉴定结果与田间形态鉴定结果一致。因此，利用这2对特异性引物可对津甜100杂交种进行纯度鉴定。

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