通过分析ki67 与肝癌患者体外药敏实验的关系预测临床用药

赵鱼扉，史政荣

（重庆医科大学附属第一医院 肝胆外科，重庆）

0 引言

原发性肝癌是全球致死率第三的恶性肿瘤，在亚洲地区大多因乙型肝炎病毒感染导致，其好发于中年人群，且男性发病率更高[1]。原发性肝癌病因尚未明确，而肝硬化、肝炎病毒复制活跃被认为与其发病相关，且大多数肝癌早期患者临床症状不典型，常常错过了最佳诊疗时机[2]。ki67 是一种反应细胞增殖活跃程度的相关抗原，有研究表明在恶性肿瘤患者中，其表达率越高，预后越差[3]。有研究表明ki67 在肝癌患者中的表达水平能一定程度上预测肝细胞癌（HCC）的术后复发[4]。高通量药物敏感性筛选是一种确定药物敏感性的新方法，具有药物覆盖范围广、效率高和个性化强的优点。与其他药物敏感性筛选方法相比，它具有经济、检测迅速、易于推广的优点[5]。本项研究通过使用高通量药物敏感性筛选来鉴定个体患者的HCC 细胞敏感药物，再比较这些药物在ki67 高表达组与低表达组中对肿瘤细胞的抑制率，根据其结果在一定程度上指导临床用药。目前国内外关于ki67 与体外药敏实验的研究甚少，本课题组之前已经证明了体外高通量药敏实验能在一定程度上指导临床用药，本次实验拟评估其与免疫组化指标ki67 之间的关系，也在一定程度上指导临床用药[6]。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2013 年1 月至2017 年6 月于重庆医科大学附属第一医院肝胆外科接受根治性肿瘤切除术的64 例肝癌患者，手术过程中取病灶组织进行高通量药敏实验，并使用免疫组织化学法测定各标本ki67 表达率，将ki67 高表达（ki67＞25%）的患者设为观察组，将ki67 低表达（ki67＜25%）的设为对照组。共64 例肝癌患者，其中ki67 高表达组患者36 例，ki67低表达组患者28 例，各组临床资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。纳入研究的所有患者术前均显示HCC，术中肿瘤完全切除，术后经病理检查发现HCC，胆管癌或混合细胞癌，并具有特定的免疫组化结果。所有患者均提供书面知情同意书，该研究得到重庆医科大学附属第一医院伦理委员会的批准（第2019-021 号），并符合1975 年修订的《赫尔辛基宣言》伦理准则。已在中国临床试验中心（https://www.chictr.org.cn）注册，注册号为ChiCTR1900022193。

1.2 方法

所有肝癌患者标本均运输并保存在4 ℃下。通过用消化酶消化获得原代癌细胞。在体外扩增癌细胞后将细胞悬浮液（10 μL）加入RPMI 1640 培养基（80 μL）中并与台盼蓝染料充分混合。然后将混合物的等分试样（10 μL）放在血细胞计数板上，对四个大正方形中的细胞总数进行计数。细胞浓度（细胞数/1 mL 细胞悬液）的计算公式为：4 个大方块中的细胞总数/4×104×10（稀释倍数）。通过比较死细胞（染色为蓝色）和活细胞（未染色）的数量来评估原代细胞的生存能力。为了评估药物敏感性，将原代癌细胞接种到临床药物筛选板上，用临床实践中使用的药物（单一疗法或联合疗法，共14 种药物）进行治疗。其中单一药物有表柔比星、氟尿嘧啶、索拉非尼等，药物组合的例子是阿霉素+奥沙利铂和吉西他宾+奥沙利铂。这些浓度是临床实践中使用的浓度，符合国际药物标准。将抑制率＞40%的结果设置为药物有效。

1.3 统计学方法

应用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。计数资料行χ2检验，采用率（%）表示，计量资料行t检验，采用均数± 标准差（）表示，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 使用单药如表柔比星、氟尿嘧啶等在ki67 不同表达组中的比较

在体外药敏实验中使用表柔比星、氟尿嘧啶等单一药物，ki67 高表达组与低表达组在肿瘤增殖抑制率上差异无统计学意义（P＞0.05），详见表1、表2。

表1 表柔比星在ki67 不同表达组中的比较[n(%)]

表2 氟尿嘧啶在ki67 不同表达组中的比较[n(%)]

2.2 联合用药如吉西他宾+奥沙利铂等在ki67 不同表达组中的比较

在体外药敏实验中使用吉西他宾+奥沙利铂联合用药，ki67 高表达组与低表达组在肿瘤增殖抑制率上差异无统计学意义（P＞0.05），详见表3。

表3 吉西他宾+奥沙利铂在ki67 不同表达组中的比较[n(%)]

2.3 使用阿霉素+奥沙利铂在ki67 不同表达组中的比较

在体外药敏实验中使用阿霉素+奥沙利铂联合用药，ki67 高表达组中阳性率明显高于ki67 低表达组，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表4。

表4 阿霉素+奥沙利铂在ki67 不同表达组中的比较[n(%)]

3 讨论

在本项研究中，我们通过体外高通量药物敏感性来评估，对于个体患者的肿瘤细胞，哪些药物能有效抑制其增殖[7-8]。再通过统计学方法，分析ki67 表达不同的患者与体外高通量药敏实验结果的关系，得出结论：在ki67 高表达肝癌患者的体外药敏实验中，使用阿霉素+奥沙利铂能明显抑制肿瘤细胞的增殖。由于本科研组已在之前研究中证明了，体外高通量药敏实验能在一定程度上指导临床用药[9-10]。所以本次研究的结果，我们认为也能在一定程度上指导临床用药，即术后病检提示ki67 高表达的肝癌患者，使用阿霉素+奥沙利铂联合用药，更有利于患者预后。

细胞核ki67 蛋白与细胞增殖有关，其在G2/M 期高表达。而阿霉素等化疗药物的药理作用为进入细胞核内干扰转录过程，阻止mRNA 的合成，在细胞分裂的G2 期阻断细胞周期及抑制肿瘤生长，笔者推测，这可能是ki67 高表达患者使用阿霉素+奥沙利铂联合用药后肿瘤细胞抑制更有效的原因[11]。本研究为单中心、小样本的研究，存在一定的局限性，且此次研究仅为体外药敏实验与免疫组化间的对照，并未结合患者在临床上的复发及总体生存率，一项多中心的、前瞻性的临床研究是下一步研究的方向。