雪茄烟叶晾制过程色素降解和膜脂过氧化对颜色变化的影响

范宁波，蔡斌，张瑞娜，高华军，邹宇航，宋朝鹏，路晓崇*

1 河南农业大学烟草学院，郑州 450002；

2 中国烟草总公司海南省公司海口雪茄研究所，海口 571100；

3 四川省烟草公司德阳市公司，德阳 618400

近年来，随着物质生活水平的提高，人们对雪茄产品的需求量不断增加，对雪茄原料的要求也越来越高，而雪茄烟的外观质量是雪茄质量评价的重要指标，雪茄烟叶在调制过程中的颜色变化直接影响其外观质量[1]。雪茄烟叶调制过程的颜色变化一般为由绿变黄，最终固定为褐色。烟叶变色过程伴随着色素降解和膜脂氧化等生理变化[2]，因此在雪茄烟叶调制的四个时间段（萎蔫期、变色期、定色期、干筋期）中，变色期是最关键的一个时期[2]。雪茄烟叶颜色的变化受多种因素的影响，如水分含量的变化[2-3]、色素的降解和细胞膜脂的氧化等[4-5]，时向东[6]等发现调制过程中温度较高时有利于烟叶内含物质的降解，使烟叶颜色均匀一致；顾会战[7]也认为，高温高湿条件有利于烟叶颜色的形成。另外，与自然晾制相比，采用晾房晾制可以有效改善烟叶的变色情况[8-9]。色素的降解和膜脂氧化与烟叶的颜色变化有直接的关系，而细胞膜脂主要包括糖脂和磷脂（Phospholipids，PL），糖脂又主要包括单半乳糖甘 油 二 酯（Monogalactosyldiacylglycerol，MGDG）和双半乳糖甘油二酯（Digalactosyldiacylglycerol，DGDG）[10-12]。不饱和脂肪酸的氧化使得膜脂过氧化加剧，容易导致褐变的发生[13-14]。另外，膜脂的过氧化作用会导致叶绿体膜系统的破坏，使叶绿素含量下降[15-16]。本文以“德雪7号”中部叶为试验材料，在恒温恒湿箱中进行雪茄烟叶的晾制，探究雪茄烟叶晾制过程色素降解和膜脂氧化对烟叶颜色变化的影响，旨在对雪茄烟叶在晾制过程中颜色的形成提供一些理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2018—2019年在四川省什邡市师古镇大泉坑村雪茄烟叶生产基地进行，供试品种为德雪7号，试验田土壤pH值5.8～7.0，有机质含量13.01g/kg，速效钾含量89 mg/kg，速效磷含量38.1 mg/kg，速效氮含量120 mg/kg，按照当地常规优质雪茄烟叶生产技术规范进行统一管理[2]。

基金项目：四川省烟草专卖局科技项目（SCYC201809）

作者简介：范宁波（1995—），在读硕士研究生，研究方向为烟草调制加工，Email：bnf1995@126.com

通讯简介：路晓崇（1988—），硕士研究生，主要从事数据挖掘与烟叶调制生理研究，Email：ruciyubici @163.com

收稿日期：2020-04-15；网络出版日期：2020-12-30

1.2 试验设计

选取处于大田成熟期，长势基本一致的适熟烟叶，置于3 台规格、型号完全一致的恒温恒湿箱（HWS型恒温恒湿培养箱，北京中兴伟业仪器有限公司）中进行晾制，每台设备中晾制烟叶40片，一共120片烟叶。参照邹宇航等人的四川雪茄调制技术参数进行温湿度参数的设置[3]。雪茄调制的最关键时期为变色期[17]，因此针对该特性，自晾制当天起（鲜烟叶），固定3片烟叶，每2天拍照记录，并利用Photoshop软件测定烟叶的变黄、变褐程度；另外，每2天取样1次，用于其他生理指标的测定。每次取样选取6 片具有代表性的烟叶样品（每台设备中选取2片），直至烟叶变色完成。（1）烟叶中色素含量的测定：每次选取烟叶中间部位叶片组织用于色素含量的测定；（2）烟叶膜脂的测定：取烟叶中间部位叶片组织（注意避开叶脉），并迅速转移至-70℃超低温冰箱中保存，用于膜脂MGDG、DGDG、PL的测定。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 变黄、变褐程度测定

参照汪代斌等[18]的方法，将白色背景布平整地铺于实验台上，将用来跟踪记录外观变化的3片烟叶铺于上面，用相机拍照，并利用Photoshop像素法计算烟叶变黄部分面积、变褐部分面积与总叶片面积的比值，进而计算烟叶的变黄程度、变褐程度。

1.3.2 烟叶色素含量测定

叶绿素、类胡萝卜素含量采用95%乙醇浸提法提取，并使用分光光度法进行色素的测定[19]。

1.3.3 烟叶中膜脂含量的测定

用纯化的植物双半乳糖甘油二酯（DGDG）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入植物双半乳糖甘油二酯（DGDG），再与HRP标记的双半乳糖甘油二酯（DGDG）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的植物双半乳糖甘油二酯（DGDG）呈正相关。用酶标仪在450 nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中植物双半乳糖甘油二酯（DGDG）浓度。单半乳糖甘油二酯（MGDG）、磷脂（PL）（上海酶联试剂有限公司）的测定方法同DGDG。

1.4 数据分析

采用SPSS22.0 软件统计分析数据，Microsoft Excel 2010进行图形的绘制；利用PSCC2019进行照片的分析。

2 结果与分析

2.1 烟叶晾制过程中变黄、变褐程度的变化

由图1可见，由于烟叶在刚开始晾制时保持绿色，因此变色程度都保持为0。但晾制第2天时，烟叶已经开始变黄，并且在接下来的两天中，其变黄速率极快，到第10天时，变黄速度减缓，变黄基本完成，并在第12天时，变黄完成。与烟叶变黄规律不同，烟叶在晾制初期，烟叶基本不变褐，随着时间的延长，变褐启动，其速率也开始逐渐加快，并约在2周后变褐完成，变褐程度达到了100%。

图1 烘烤过程中烟叶变黄、变褐程度变化Fig. 1 Changes in the degree of yellowing and browning of cigar tobacco leaves during air curing

2.2 雪茄烟叶晾制过程中质体色素含量和类胡萝卜素含量/叶绿素含量的变化

由图2可知，叶片中色素的含量呈逐渐降低的趋势，且叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、类胡萝卜素的降解速率在烟叶的变黄阶段均较快，在烟叶基本变黄之后降解速率较为缓慢。在烟叶颜色变化完成时，总叶绿素含量减少了80.96%，类胡萝卜素含量降低了65.94%。在晾制开始时，类胡萝卜素的含量占据了总色素的15.52%，而在变色完成时，类胡萝卜素的相对含量占据了24.74%，其相对含量有所增加。进一步分析类胡萝卜素与叶绿素比值的变化，结果显示雪茄在调制过程中，两者之间的比值表现出先升高后降低的变化趋势。

图2 烟叶晾制过程中叶绿素、类胡萝卜素含量和类胡萝卜素含量/叶绿素含量的变化Fig. 2 Changes of chlorophyll, carotenoid content and carotenoid / chlorophyll in cigar tobacco leaves during air curing

2.3 烟叶晾制过程中膜脂含量和组成成分的变化

如图3所示，随着调制进程的增加，烟叶中单半乳糖甘油二酯（MGDG）、双半乳糖甘油二酯（DGDG）、磷脂（PL）的含量逐渐降低，尤其是进入变褐阶段，即变色中后期时，膜脂的含量急速降低。在晾制初始时，MGDG、DGDG、PL的含量分别为178.49 ng/g、956.05 ng/g、2262.53 μg/g，变色完成时，3种膜脂的含量分别仅为78.27 ng/g、498.18 ng/g、1455.47 μg/g，MGDG、DGDG、PL分别降解了降了45.9%、64.1%和51.9%（P＜0.05），这表明了烟叶在调制过程中发生了膜脂的降解。脂类物质降解时，DGDG /MGDG 比值却随着晾制时间的增加而逐渐升高，2周之后，两者之间的比值从5.37增加到了6.37，增加了18.6%。

图3 烟叶中膜脂含量和DGDG / MGDG的变化Fig. 3 Changes of membrane lipid content and DGDG / MGDG in cigar tobacco leaves during air curing

2.4 晾制过程中烟叶颜色变化与色素和膜脂含量变化的相关分析

由表1可知，叶片的变黄程度的大小分别与叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素以及类胡萝卜素之间均呈极显著负相关关系，与类胡萝卜素含量/叶绿素含量之间呈极显著正相关关系；变褐程度与色素含量均呈极显著负相关，与类胡萝卜素/叶绿素呈极显著正相关关系。由表2可知，烟叶的变黄程度和变褐程度与DGDG、MGDG以及PL含量之间均呈极显著负相关关系，与DGDG / MGDG之间呈极显著正相关关系。

表1 晾制过程中变色指数与色素含量和类叶比之间的相关分析Tab. 1 Correlation analysis between the coloring index, pigments content and Carotenoid / Chlorophyll during air curing

表2 晾制过程中变色指数与膜脂含量之间的相关分析Tab. 2 Correlation analysis between the coloring index and the content of membrane lipids during air curing

2.5 晾制过程中变色指数与色素含量、膜脂含量之间的回归分析

分别以晾制过程中烟叶的变黄程度（Ŷ1）、变褐程度（Ŷ2）为因变量，以叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、类胡萝卜素、类胡萝卜素含量/叶绿素含量、单半乳糖甘油二酯（MGDG）、双半乳糖甘油二酯（DGDG）、磷脂（PL）以及DGDG / MGDG（X1-X9）为自变量，进行逐步回归分析，建立雪茄在晾制过程中烟叶色素含量、膜脂含量对颜色变化的贡献的预测方程：

由上述分析可知，雪茄在晾制过程中烟叶的变色程度与叶绿素、类胡萝卜素、膜脂等各指标的的回归方程拟合度较好，方差分析结果均达到了极显著水平，表明烟叶中色素和膜脂的含量对雪茄烟叶在晾制过程中颜色的形成有极大的贡献。

3 讨论

烟叶颜色的变化不仅仅是简单的外在变化，更是与烟叶内含物分解和转化等生理生化变化密切相关[20]。其中，质体色素的降解不仅是影响烟叶颜色变化的重要因素[20]，也是影响烟叶香气质形成的重要因素[5]。在雪茄烟叶的调制过程中，叶绿素和类胡萝卜素含量随着调制时间的延长而降低，类胡萝卜素含量/叶绿素含量的值也随之呈现先增大后减小的趋势，这可能是由于叶绿素降解幅度较大，类胡萝卜素的降解幅度较小，由此引起叶组织内色素比例的变化，造成了类胡萝卜素相对含量增加，从而导致烟叶的颜色逐渐由绿色转为黄色[20-21]。随着烟叶晾制时间的延长，烟叶的变黄程度、变褐程度均逐渐增加，直至烟叶最终褐变完全。相关分析表明，烟叶的变黄、变褐与色素的含量密切相关（表1），这说明色素含量的变化是导致烟叶颜色变化的原因之一，与卢绍浩等人的结论一致[5]。

烟叶在晾制过程中膜脂发生了降解，膜脂的主要组成成分包括糖脂（MGDG、DGDG）和磷脂（PL），MGDG 与DGDG 在结构上有较大差异，DGDG 为双层膜脂，MGDG 为非双层膜脂，且MGDG 为DGDG的合成底物[11-12]，膜脂中MGDG和DGDG的含量以及DGDG / MGDG 的比例会影响生物膜的结构和功能。烟叶的褐变与膜脂的降解密切相关[4]。周琪、阚娟[22-23]等发现在褐变的过程中，膜脂氧化的产物——MDA等物质的含量逐渐上升，这暗示了烟叶在褐变的过程中，烟叶中膜脂的组分和含量将会随之发生变化。本研究中我们发现，随着晾制时间的延长，膜脂降解，细胞膜的主要组成成分——糖脂和磷脂含量均逐渐降低，DGDG与MGDG的比值也逐渐增大，尤其是在烟叶启动变褐后，膜脂含量急剧下降，表明在烟叶在变色时发生了强烈的氧化胁迫反应，变色程度和膜脂含量之间的相关分析也证明了这一点（表2）。膜脂含量的减少是由于烟叶在调制过程中，细胞逐渐失水干瘪，在失水胁迫的影响下，细胞膜被逐渐破坏，促使了膜脂降解。DGDG 的双分子层结构会部分补偿磷脂双分子层的损伤，对膜进行重塑，有助于在最大程度上维持膜的稳定，以抵御烟叶失水所造成的胁迫[11-12]。另外，MGDG是DGDG 的合成底物，会部分转化为DGDG，以期在最大程度上减轻膜脂降解所带来的伤害。齐凌云和李倩[10,11]等人也发现，当小麦遭遇外界胁迫时，小麦叶片膜脂含量会降低，DGDG / MGDG增大。本文的研究结果与前人的研究结果一致，表明了烟叶的调制过程中发生了膜脂的降解，这将影响到细胞膜的生理功能，细胞中的多酚类物质与酶充分接触而发生美拉德反应，进而导致烟叶的褐变[24]。

色素和膜脂的降解均是导致烟叶颜色变化的重要因素，其中有研究表明，烟叶在变黄的过程中主要与色素的降解有关[5]，而褐色的形成主要与膜脂氧化有关[25]。目前关于雪茄在晾制过程中色素的降解已经有所研究报道，但是关于细胞膜脂降解与褐变之间的关系尚未见报道。本研究对晾制过程中雪茄烟叶中色素含量、膜脂含量与烟叶的变色程度进行相关分析和逐步回归分析，结果表明烟叶的颜色与色素和膜脂含量的相关性均较好，回归方程的拟合度之间也较高，因此可以认为，雪茄烟叶在晾制过程中的颜色形成与色素降解和膜脂降解之间具有密不可分的联系。

4 结论

雪茄在晾制过程中，烟叶的变色程度逐渐增加，直至烟叶完全变色；叶绿素和类胡萝卜素含量逐渐减低，类胡萝卜素含量/叶绿素含量的值先增大后减小；伴随着烟叶细胞的逐渐脱水，烟叶的细胞膜被破坏，细胞膜脂逐渐降解，其组分比例亦发生改变。色素和膜脂的降解可能导致了烟叶的变黄过程和变褐过程。本文研究了影响雪茄烟叶颜色形成的两大关键因素，旨在为雪茄在晾制过程的变色理论研究提供一些思路。