蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株防治松材线虫病研究

尹艳楠，谈家金，李梦伟，许嘉麟，郝德君

(南京林业大学林学院，南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037)

松材线虫病(pine wilt disease)是一种由松材线虫对赤松(Pinusdensiftora)、马尾松(P.massoniana)、黑松(P.thunbergii)等易感树种寄生、取食引起树种死亡的病害，由于其易传播、发病快，被称为松树的癌症[1]。自1982年在我国南京首次发现松材线虫病以来[2]，该病害相继蔓延至多个省市，现已扩张到高海拔地区和辽宁等低温地带，引起松林大片枯死，给我国的松林资源造成了巨大损失，被列为国内头号森林植物检疫对象[3-4]。

为控制松材线虫病，我国投入了大量的人力物力[5]，化学防治是目前最常用且有效的方法，但现在应用的化学杀线虫剂大多数为高毒、高残留的药剂，容易使线虫产生抗药性，且大量使用化学药剂容易产生“3R”问题[6]，对人畜极不安全，对大气、水体、土壤等环境也造成污染，破坏自然生态平衡[7]。近年来，学者们开始探究微生物对松材线虫病的生物防治作用，主要涉及的细菌有寄生细菌、根际细菌和植物内生细菌，其中有应用前景的细菌是芽孢杆菌属(Bacilllus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、巴氏杆菌属(Pasteurella)等，研究最多的仍是芽孢杆菌属细菌[8-10]。李亮亮等[11]从南京湿地松(P.elliotti)上分离出了蜡样芽孢杆菌(B.cereus) NJSZ-13菌株，初步研究表明该菌株菌体水悬液处理线虫48 h后线虫死亡率达到81.5%，并且该菌株在马尾松体内定殖能力强[12]，对松材线虫病具有良好的生物防治潜能。为避免接入线虫数量过少达不到马尾松出现松材线虫病症状或接入线虫数量过多对防治效果造成误差，笔者研究松材线虫AMA3虫株对2年生马尾松致病的最佳接种量(接种松材线虫临界值)，进一步探究温室下蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株对马尾松盆栽苗松材线虫病的防治效果，为松材线虫的有效防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

灰葡萄孢菌由南京林业大学森林病理实验室提供。

蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株由南京林业大学森林病理实验室提供。

松材线虫AMA3虫株分离自安徽省病死的黑松树体[13]，现保存于南京林业大学松材线虫虫株资源库。

NA固体培养基：蛋白胨 10 g/L，牛肉膏 5 g/L，氯化钠 5 g/L，琼脂 20 g/L，pH为7.2～7.4。

NA液体培养基：蛋白胨 10 g/L，牛肉膏 5 g/L，氯化钠 5 g/L，pH为7.2～7.4。

基础培养基：蛋白胨 10 g/L，葡萄糖 10 g/L，磷酸氢二钠 2 g/L，磷酸二氢钠 2 g/L，氯化钠2 g/L，pH为7.2～7.4。

2年生马尾松盆栽苗健康株购自广西区静怡花园有限公司，试验前先定植3个月待用。

强夯技术是利用物理学上的自由落体运动原理，让重锤从一定的高度上自由下落，由此来加固路基，提高路基的承载力。这种操作简单并且工程消耗量较小的方法，在我国公路建设过程中得到广泛的应用。该项技术可适用于多种土壤路基的加固，比如：黏性土壤、潮陷性土壤等，都可以通过使用该技术达到工程建设的质量标准。

1.2 蜡样芽孢杆菌悬液的制备

蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌悬液的制备：将发酵24 h的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株发酵液在离心机中以8 000 r/min的转速离心10 min，弃上清液，得到菌体沉淀，用无菌水冲洗2遍，配置菌体浓度为4×108cfu/mL的菌悬液。

蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌粉水悬液的制备：将以低温喷雾干燥机于105 ℃喷雾制得的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌粉溶解到无菌水中，将水悬液的菌体浓度分别调整到4×108、4×107、2×107cfu/mL。

松材线虫AMA3虫株悬液的制备：将AMA3虫株接种在长满灰葡萄孢(Botrytiscinerea)的PDA平板上，放置于25 ℃培养箱培养至灰葡萄孢菌丝消失，虫株长满平板。采用贝尔曼漏斗法[14]分离收集虫株，离心后用过氧化氢清洗，用无菌水冲洗两次作为AMA3虫株悬液，显微镜下计数每mL的虫株数量，分别将菌体浓度调制2 000、4 000、6 000条/mL。

1.3 接种松材线虫临界值测定

选择生长状态相近的2年生马尾松，利用皮接法接入松材线虫AMA3虫株[15]，每处理分别接种AMA3虫株2 000、4 000、6 000条，以无菌水作为对照，每处理5株，观察并记录发病情况。

1.4 NJSZ-13菌株发酵液、菌悬液、发酵滤液防治松材线虫病试验

选择生长状态相近的2年生马尾松幼苗，以灌根法分别施入稀释10倍后的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株发酵液、菌悬液、无菌发酵滤液各20 mL，其中发酵液和菌悬液的菌体浓度为4×108cfu/mL，以无菌水处理和培养基处理作为对照，对照组CK 1施培养基；CK 2施无菌水，CK 3施无菌水。每处理6株，7 d后处理组及CK 1、CK 2树皮接种AMA3虫株[12]，CK 3树皮接种无菌水，观察并记录发病情况。

1.5 NJSZ-13菌株菌粉防治松材线虫病试验

选择生长状态相近的2年生马尾松幼苗，以灌根法分别施入菌体浓度为4×108、4×107、2×107cfu/mL的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌粉水悬液各20 mL，以无菌水处理为对照，对照组CK 1、CK 2施无菌水。每处理6株，7 d后处理组及CK 1树皮接AMA3虫株，CK 2树皮接无菌水，观察并记录发病情况。

对2年生马尾松幼苗分别以灌根法[16]施入菌体浓度为4×108cfu/mL的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌粉水悬液20 mL和菌粉涂抹法[17]涂抹菌体含量为7.13×109cfu/g的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌粉1.12 g，以无菌水处理为对照，CK 1、CK 2均施无菌水，每处理6株，7 d后处理组及CK 1树皮接种AMA3虫株，CK 2树皮接种无菌水，记录发病情况。

1.6 马尾松发病情况观察

接种AMA3虫株后，每5天记录马尾松发病状况并计算感病指数，直至皮接AMA3虫株对照组全部发病死亡后，计算马尾松感病率、死亡率以及蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株对松材线虫病的防治效果。马尾松病情分级和病情指数的计算参照谈家金等[18]的方法：

感病指数=∑(各病级株数×病级代表值)×100/总株数×最高病级的代表值；

感病率=感病株数/接种总株数×100%；

死亡率=死亡株数/接种总株数×100%；

防治效果=(对照感病指数-处理感病指数)/对照感病指数×100%。

2 结果与分析

2.1 马尾松接种松材线虫AMA3虫株临界值分析

对2年生马尾松幼苗接种不同浓度的松材线虫AMA3虫株试验结果表明，处理3(接种6 000条AMA3虫株)的发病最快，接种20 d后马尾松就表现出松材线虫病症状；接种30 d后，处理1(接种2 000条)和处理2(接种4 000条)AMA3虫株的才表现出症状，感病指数分别为10和20，而此时的处理3感病指数已达到55(表1)。

表1 2年生马尾松接种松材线虫病害情况

接种50 d后，处理1感病指数为55，感病率和死亡率分别为60%和40%(表1)，处理2、3感病指数都达到100%，盆栽松苗全部发病且达到4级(图1)。由此可知，对2年生盆栽马尾松接种松材线虫AMA3虫株，松材线虫数量浓度越大，发病越快，感病指数越高。因处理2与处理3最终的死亡率一致，为更好地显现蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株的防治效果，故以4 000条松材线虫AMA3虫株数量浓度作为2年生盆栽马尾松接种松材线虫临界值。

图1 2年生马尾松接种松材线虫后50 d的发 病症状Fig.1 Symptoms of the pine wilt disease at 50 days after being inoculated by B. xylophilus on two- year-old P. massoniana

2.2 NJSZ-13菌株发酵液、菌悬液、发酵滤液防治松材线虫病效果比较

采用灌根法，将蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株发酵后得到的发酵液、菌悬液、无菌发酵滤液分别施于马尾松苗，7 d后接种AMA3虫株，结果显示：接种AMA3虫株后第10天，发酵液处理1、CK 1、CK 2均出现了不同程度的松材线虫病发病症状，部分松苗松针开始褪绿变黄，有的开始萎蔫，接种AMA3虫株后30 d，只有菌悬液处理2感病指数在50以下，其他处理组感病指数均在55以上，接种AMA3虫株 40 d后，CK 1、CK 2对照组及处理1、处理3全部感病死亡，发酵液和无菌发酵滤液对松材线虫病的防治效果为0，此时菌悬液处理的马尾松有两棵表现健康仍未感病，整体感病指数为67，防治效果为33%，感病率和死亡率均为67%(表2)。试验结果表明，采用灌根法对马尾松苗施入蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株的发酵液和无菌发酵滤液均不能对松材线虫病起到预防作用，施入蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌悬液对松材线虫病有一定的预防效果。

表2 蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株发酵物对马尾松苗松材线虫病的防治效果

2.3 不同施用浓度下NJSZ-13菌粉防治松材线虫病效果比较

采用灌根法以不同菌体浓度的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌粉水悬液处理马尾松，7 d后接种AMA3虫株，结果显示：接种AMA3虫株后第10天，施菌粉水悬液2×107cfu/mL的处理4与CK 1均出现松材线虫病症状，松针失水变黄，出现萎蔫。接种AMA3虫株后40 d，CK 1全部发病死亡，施菌悬液(4×108cfu/mL)的处理1 防治效果为33%，施菌粉水悬液4×108cfu/mL的处理2和4×107cfu/mL的处理3的防治效果均为37%，而处理4的防治效果为21%(表3)。在整个发病过程中，CK 1感病指数均高于4组处理，而空白对照组CK 2均未表现出发病症状。试验结果表明，同一菌体浓度下蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌粉水悬液和发酵菌悬液对松材线虫病的预防效果相当；当菌体浓度达到一定值以后，增加浓度也不会提高防效。

表3 不同施用浓度下蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌粉对松材线虫病的防治效果

2.4 不同施用方式下NJSZ-13菌粉防治松材线虫病效果比较

研究发现，以蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌粉水悬液灌根法和菌粉涂抹法两种方式处理2年生马尾松幼苗，7 d后接种AMA3虫株，在接种AMA3虫株后第10天时，CK 1出现松材线虫病症状，灌根处理1和涂抹处理2均未感病，松苗正常生长，在15 d以后，处理1和处理2开始出现松材线虫病发病症状，接种AMA3虫株后第40天，CK 1全部死亡，此时处理1的感病指数为67，防治效果为33%；处理2的感病指数为63，防治效果为37%(表4)。试验结果表明，将蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌粉直接涂抹松枝，与灌根菌粉水悬液的方法相比，两者对松材线虫病的防治效果相当。

表4 不同施用方式下蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌粉对松材线虫病的防治效果

2.5 不同施用时间下NJSZ-13菌粉防治松材线虫病的效果比较

本次试验中，处理1在马尾松接种AMA3虫株前7天，处理2接种AMA3虫株当天和处理3接种AMA3虫株后7天分别以灌根法施入4×108cfu/mL的NJSZ-13菌株菌粉水悬液20 mL，试验结果显示：接种AMA3虫株后第10天，处理3就出现松材线虫病症状，在接种AMA3虫株的10～40 d，感病指数与CK 1基本吻合(表5)，接种AMA3虫株后第40天时，处理3与CK 1的马尾松已全部死亡，处理3的防治效果为0，此时，处理2全部感病，但并未全部死亡，感病指数为88，防治效果为12%；而处理1感病指数为67，防治效果最好(33%)，处理2防治效果比处理1低。原因可能是接种AMA3虫株和施蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株同时进行，菌体在马尾松体内的定殖扩展速度较松材线虫慢。由此可见，蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株对马尾松松材线虫病的预防效果要大于治疗效果，原因可能是接种松材线虫前7天或者当天施用该菌的处理组在松材线虫进到植株内时，菌株已在植株体内定殖，从而对松材线虫产生作用，马尾松在感染松材线虫之前以灌根法施入蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株的防治效果会更好。

表5 不同施用时间下蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌粉对松材线虫病的防治效果

3 讨 论

本研究对温室内具有杀线虫作用的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株防治松材线虫病的防治效果进行了初步探究，蜡样芽孢杆菌菌悬液对盆栽马尾松松材线虫病的防治效果最好；蜡样芽孢杆菌使用浓度增加会提高对松材线虫病的防治效果，当浓度达到一定值后，防治效果不再随浓度的增大而提高；蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株对松材线虫病的预防效果大于治疗效果；通过灌根法和涂抹松枝法两种方式施菌试验对松材线虫病的预防效果相当。

松材线虫病自被发现以来，呈蔓延趋势发展，国内外一直重视松材线虫病防治技术的研究[19]，尤其是以松材线虫为靶标，利用具有杀线虫作用的微生物进行生物防治技术研究，现已有多名研究者发现对松材线虫具有杀线虫活性的细菌，朱丽梅等[20]在马尾松上分离到1株解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、Niu 等[21]从土壤中分离到1株芽孢杆菌菌株B16、罗兰等[22]筛选出2株苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)菌株；Zheng等[23]分离到1株缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta) LCB-3菌株；王方等[24]分离到1株FlectobacillusrhizosphaeraeG8-1菌株。南京林业大学病理实验室从美国松材线虫上分离到1株嗜麦芽窄食单胞菌 (Stenotrophomnasmaltophilia) Smal-007菌株，该菌株因致病力弱且是线虫体表优势菌株，定殖能力强，可有效降低黑松苗的感病指数，可作为生防细菌的候选菌株[25-26]，后期将菌株Smal-007发酵液喷洒到福建等地野外松林，明显降低了松树的病死率[27]。本研究利用李亮亮等[11]筛选出的具有杀线虫作用的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株，从不同的发酵产物、施菌浓度、施用方式、时间进行防治松材线虫病的探究得到，一定浓度下的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株菌悬液和菌粉水悬液对松材线虫病均表现出较好的预防效果，通过菌粉涂抹法处理松枝也可以将菌体成功接种到马尾松体内，这与He等[17]采用涂抹叶片接种法将枯草芽孢杆菌(B.subtilis)BS-2菌株成功接种到多种植物体内相一致，从而发挥对松材线虫病的预防效果，因此蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株防治松材线虫病的温室试验进一步表现出该菌株具有良好的生防潜能。

蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株对松材线虫的拮抗机制还不清楚，此次研究该菌在马尾松苗上对松材线虫病的防治效果还不是很好，且处理组只有6株松苗，未能很好地排除试验误差，今后在弄清其拮抗机制的基础上，可考虑从遗传改良工程菌构建、菌剂复配等方面进一步提高其防治效果。