UPLC-MS/MS同时测定铁皮石斛茎、叶、花中酚类组分的含量

黄 彪，何 伟，吴建鸿，王红梅，李 巍

（1.福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，福建 福州 350003；2.福建省农产品质量安全重点实验室，福建 福州 350003；3.福建连天福生物科技有限公司，福建 龙岩 366200）

铁皮石斛（Dendrobium officinale）是兰科石斛属中草药植物，为2015版《中华人民共和国药典》收载的珍稀名贵中药材，位居“九大仙草之首”。铁皮石斛中含有多糖[1-2]、生物碱[3-4]、联苄衍生物[5-6]、氨基酸[7-8]、类黄酮[9-10]、酚酸[11-12]等多种活性成分，具有抗氧化[13-14]、抗肿瘤[15-16]、增强免疫[17]等作用。在本草考证中以茎为药用部分，但在《中国药典》及很多现代文献中均将石斛全草为药用部分，以前市场上的铁皮石斛制品如石斛枫斗、胶囊、石斛粉主要是以石斛茎部原料加工成产品，而较少以石斛叶、花为原料。近年来，随着石斛种植面积的不断扩大，铁皮石斛多样性产品的不断丰富，对铁皮石斛茎以外的材料如叶、花部位的化学成分深入研究也引起了研究者兴趣[18-21]。

植物多酚是一类存在于植物中的多羟基酚类化合物的总称，具有抗氧化、防癌抗癌、杀菌、抗炎等功效。已有报道多为对铁皮石斛中总酚含量的分析[22-24]，有关铁皮石斛中酚类物质具体组分的研究较少，文献中有关铁皮石斛中酚类化合物的研究仅有李燕[11]和李岩[12]等关于铁皮石斛茎部酚酸类组分的分析，铁皮石斛茎、叶、花中酚类组分的分析鲜见报道。

相对于液相色谱仪，超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）仪分析速度更快，灵敏度更高，抗基质“干扰”能力更强。UPLC-MS/MS仪将目标物简单分离后，通过诱导碰撞使目标化合物母离子能够裂解为特定的碎片离子，进一步确证化合物的结构，可以有效避免假阳性结果，对于基质复杂、干扰严重的痕量化合物能够进行很好的定性、定量，非常适用于中药材样品中多组分化合物的快速、准确分析。本研究基于相关方法基础[25-28]，建立UPLC-MS/MS同时测定多种酚类组分的方法，对铁皮石斛茎、叶、花中酚类组分含量进行测定，旨在为铁皮石斛茎、叶、花营养功能成分的深入认识提供数据支撑，为铁皮石斛多样性产品的开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

铁皮石斛茎、叶、花（干样）采集于福建省龙岩市连城县福建连天福生物科技有限公司铁皮石斛生产基地。

3,5-二羟基苯甲酸、橘皮素、绿原酸、槲皮素、芦丁、对羟基苯甲酸、2,5-二羟基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸、香草酸、根皮苷、山柰酚、对香豆酸、芥子酸、阿魏酸、3-羟基肉桂酸、2-羟基肉桂酸、水杨酸（纯度均不小于97%） 南京道斯夫生物技术股份限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯） 德国Merck公司；乙酸铵、甲酸（LC-MS级） 美国Waters公司；其他试剂为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UPLC H-Class超高效液相色谱仪、Xevo TQ-S三重四极杆质谱 美国Waters公司；Direct-Q5超纯水仪美国Millipore公司；SYG-2水浴恒温振荡器 常州朗越仪器有限公司；KQ-600B型超声清洗器 昆山市超声仪器公司；XW-80A旋涡混合器 上海医科大学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 UPLC条件

色谱柱：Waters T3 C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱温30.0 ℃；流速0.2 mL/min；进样量4 μL；流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：0～4 min，90%～30% A，10%～70% B；4～6 min，30% A，70% B；6～8 min，30%～50% A，70%～50% B；8～9 min，50%～90% A，50%～10% B；9～10 min，90% A，10% B。

1.3.2 MS条件

检测方式：电喷雾离子源正、负离子模式，多反应监测；毛细管电压1.5 kV；锥孔气流：氮气，流速50 L/h；脱溶剂温度500 ℃，流速800 L/h；离子源温度150 ℃；雾化气压力0.28 MPa；碰撞气：高纯氩气。以500.0 μg/L的各酚类化合物的单标溶液进行质谱参数优化，确定特征母离子和子离子。

1.3.3 标准溶液的配制

准确称取3,5-二羟基苯甲酸等18 种标准品各10.0 mg，分别用甲醇溶解定容至10.00 mL，得到各化合物质量浓度为1 000 mg/L的单标母液，稀释母液配制10.0 mg/L的单标中间液，于-20 ℃冰箱中保存。用于制作标准工作曲线的不同质量浓度混标溶液，现配现用。

1.3.4 样品前处理

铁皮石斛中活性成分的提取参考黄琴等[23]的方法稍加改进，称取0.500 g磨碎的干燥的铁皮石斛样品加入5 mL 70%甲醇溶液于棕色玻璃管中，于70 ℃水浴中振荡提取30 min，提取后自然冷却至室温，将提取液转移至离心管中，5 000 r/min离心5 min，然后将上清液全部转移至10 mL容量瓶。残渣再加入5 mL 70%甲醇溶液提取一次，重复以上操作。合并提取液定容至10.0 mL，摇匀，0.22 μm滤膜过滤，滤液待上机分析用。

1.4 数据处理

Excel 2007对实验数据进行整理，每个样品进行3 次重复实验；DPS 7.05进行数据统计及差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

实验中考察以甲醇-水和乙腈-水作为流动相以及在流动相中添加甲酸、乙酸铵对目标化合物离子色谱峰峰形及响应信号的影响。实验表明：采用0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸铵溶液和乙腈为流动相，在正、负离子扫描模式下，大多数酚类组分有良好的峰形。因此，实验中采用0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸铵溶液和乙腈作为流动相。

2.2 质谱条件的优化

表1 酚类化合物检测的质谱参数条件Table 1 Mass spectrometric parameters for detection of phenolic compounds

Waters三重四极杆质谱条件的优化主要包括选择各化合物的母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量等参数的确定。配制500.0 μg/L的18 种酚类组分单标溶液，流动相A为0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈（1∶1，V/V），标准溶液经质谱直接进标准溶液，采用电喷雾正离子模式和负离子模式通过自动调谐的方式分别对各化合物单标溶液进行母离子、子离子扫描。实验发现橘皮素、槲皮素、根皮苷在正离子扫描模式，更容易得到稳定的母离子及子离子，响应信号更好。而其他化合物则在负离子扫描模式下，更容易得到稳定的母离子及子离子。优化条件下相关质谱检测参数见表1，各化合物的多反应监测色谱图见图1。

图1 18种酚类化合物多反应监测色谱图Fig.1 MRM chromatograms of 18 phenolic compounds

2.3 色谱柱的选择

在实验中比较了分别使用Waters BEH C18柱和Waters T3 C18柱，在选用甲醇-水和乙腈-水不同流动相体系对18 种酚类组分的保留和分离情况。实验发现Waters T3 C18对极性的酚类组分分离效果更好，具有更窄的峰形，因此实验中选用Waters T3 C18作为分离柱。

2.4 基质效应的影响

基质效应是指样品分析液中由于分析物以外的其他组分的作用影响了分析物的响应值，从而影响定量分析的准确度和重复性。因为待测样品中本身含有待测组分，为考察未知组分基质的影响，采用标准添加法进行实验。实验中，测定样品中加入各待测组分2.00 mg/kg和5.00 mg/kg的响应值，2 次测得的响应值之差记为C，实际加入的标准溶液理论值之差记为C0。平行测定6 次，取平均值，用C/C0的比值确定基质效应。比值越接近1，基质效应越小。斜率比在0.80～1.20之间，则认为基质效应影响不明显；反之，则认为基质效应对定量检测具有较大的影响，不可忽略。如表2所示，对大部分待测物铁皮石斛样品的基质抑制效应影响不明显。

表2 基质效应的影响Table 2 Evaluation of matrix effect

2.5 线性范围、检测限和定量限结果

按照目标化合物离子的响应情况，配制不同质量浓度混合标准溶液，按照优化的条件进样，以标准溶液质量浓度（x，μg/L）与对应的峰面积（y）建立标准曲线得出线性回归方程。如表3所示，在2.5～8 000 μg/L质量浓度范围内，各目标化合物线性关系良好，相关系数为0.996 1～0.999 8。方法的检出限和定量限分别为0.4～5.6 μg/L和1.2～15.2 μg/L。

表3 18种目标化合物检测的方法学验证Table 3 Figures of merit for the determination of 18 analytes by UPLC-MS/MS

2.6 重复性实验

分别称取铁皮石斛茎、叶、花样品，称取0.500 g平行6 份，精密称量，按照1.3.4节方法进行样品前处理，将制备的待测液进行UPLC-MS/MS分析，根据标准曲线方程得出待测物含量及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），检出分析物的RSD均小于5.2%，表明方法的重复性良好。

2.7 加标回收率实验

低、中、高水平加标回收实验重复6 次。根据样品中酚类化合物的含量及各化合物的线性范围，确定各化合物在基质中合适的加标量；对未检出的组分在定量限水平参考GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》中要求进行加标。加标实验平均回收率为73.4%～99.8%，RSD为1.2%～8.9%，见表4。实验结果表明分析方法准确度较好，能满足检测的要求。

表4 酚类化合物的加标回收实验Table 4 Spiked recoveries and relative standard deviations of phenolic compounds

2.8 铁皮石斛茎、叶、花中酚类组分含量的检测分析

按建立的UPLC-MS/MS法对铁皮石斛茎、叶、花各部分的酚类化合物成分进行检测分析，每个样品重复测定3 次。如表5所示，在铁皮石斛样品中共检出15 种酚类化合物，相对于其他酚类组分，芦丁在铁皮石斛茎、叶、花中的含量均为最高，其中铁皮石斛茎、叶、花中芦丁的含量分别为（60.74±1.88）、（107.24±9.89）、（145.21±9.26）mg/kg，三者之间存在极显著性差异（P＜0.01）。铁皮石斛不同部位多酚组分含量为花＞叶＞茎；铁皮石斛不同部位主要酚类组分表现出一定的差别：铁皮石斛花中含量较高的为芦丁、咖啡酸、阿魏酸和对羟基苯甲酸，铁皮石斛叶中芦丁和阿魏酸的含量相对较高，而在铁皮石斛茎部主要酚类组分则为芦丁、阿魏酸与香草酸。

表5 铁皮石斛样品中酚类化合物含量Table 5 Contents of phenolic compounds in D. officinale samples as determined by UPLC-MS/MS mg/kg

铁皮石斛位居“九大仙草之首”，因其较高的保健作用与药用价值，在《中国药典》中单列以区别于其他石斛。铁皮石斛中石斛多糖的含量较高，《中国药典》中以石斛多糖和甘露糖作为铁皮石斛质量控制的指标。随着铁皮石斛多样性产品的开发，对铁皮石斛茎部以外的部分如叶、花材料的化学成分的研究也逐渐加深。酚类是植物中的天然抗氧化剂，被认为与清除自由基、抗氧化、抗衰老相关。铁皮石斛茎、花部位含有较为丰富的酚类及黄酮类物质[22-24]，黄琴等[23]的研究表明铁皮石斛不同极性提取物具有较强的体外抗氧化活性，且各提取物抗氧化活性与总酚含量和总黄酮含量之间有明显的相关性，说明酚类或黄酮类成分是铁皮石斛抗氧化活性的重要物质基础。近年研究表明，石斛酚类化合物中双联苄类化合物具有良好的生物活性[29]，不同结构的酚类化合物的生物活性也有一定的差异。有关铁皮石斛中酚类物质具体组分的研究较少，分析探究铁皮石斛不同部位抗氧化活性成分如酚类与黄酮类物质的具体组成，对于铁皮石斛资源药用价值的探究具有一定的参考作用。

在石斛样品不同部分中各检测组分的含量，芦丁最高，阿魏酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸等亦有较高含量，分析所得的铁皮石斛茎中酚类组分含量高低与吕朝耕[10]、李岩[12]等报道的数据结果较为一致。而本研究通过铁皮石斛茎、叶、花中酚类组分的比较也表明，铁皮石斛花中芦丁、阿魏酸、对羟基苯甲酸的含量均高于铁皮石斛茎部位，从抗氧化性活性组分的利用方面考虑，将铁皮石斛花材料作为茎的补充材料加以利用具有一定的实际意义。

3 结 论

通过对色谱、质谱条件的优化，建立同时、快速检测18 种酚类化合物的UPLC-MS/MS法，并用所建立的方法分析铁皮石斛茎、叶、花中酚类组分的含量。铁皮石斛不同部位多酚组分含量为花＞叶＞茎，相对于其他酚类组分，芦丁在铁皮石斛茎、叶、花中的含量均为最高。铁皮石斛不同部位主要酚类组分的含量表现出显著性差异：铁皮石斛花中主要含有芦丁、咖啡酸、阿魏酸和对羟基苯甲酸，铁皮石斛叶中芦丁和阿魏酸的含量相对较高，而铁皮石斛茎部主要酚类组分则为芦丁、阿魏酸与香草酸。这些酚类物质可能与铁皮石斛的抗氧化、增强免疫力、抗种类等功效有密切关系。研究结果有利于对铁皮石斛中活性组分的深入研究，对铁皮石斛多样性产品的开发利用也有一定的参考价值。