苹果多酚/果胶相互作用及其对浊汁体系理化特性和稳定性的影响

任佳琦，刘 昕，雷 琳，赵吉春，曾凯芳,2，明 建,2,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.西南大学食品贮藏与物流研究中心，重庆 400715）

随着消费者健康意识的不断增强，“新鲜、健康、天然、安全”的非浓缩（not from concentrate，NFC）果汁越来越受到消费者的青睐，市场占有率不断攀升。NFC果汁分为清汁、浊汁及果肉果汁3 类，其中苹果浊汁通常会去除大块果肉以维持体系的浑浊稳定性，是较为常见的NFC果汁类型[1]。而浊汁产品稳定性不佳是制约该产业发展的关键因素。研究表明，果胶、多酚及蛋白质等物质会发生相互作用导致云状颗粒物在体系生成、聚集及失稳，引起浊汁稳定性下降[2]，而云状颗粒物的稳定性与其粒径大小，体系黏度等因素有关[3]。

苹果果胶是一种由D-半乳糖醛酸和中性糖组成的酸性杂多糖，既存在于苹果浊汁溶液中，也存在于浊汁云状体系中。苹果果胶对于维持浊汁稳定性具有良好效果，能够在浊汁体系内的颗粒外形成较好的包裹体系，为相互作用的颗粒提供保护涂层，进而增加体系稳定性[2]。且果胶对体系的稳定效果与其含量及相对分子质量有关，Shomer等[4]研究发现橙汁的絮凝程度会随着果胶含量及相对分子质量大小而改变，果胶会随着浊汁贮藏时间的延长及环境温度的上升而发生降解，导致浊汁体系黏度下降，果汁出现变清、分层等稳定性下降现象[5]。目前，关于浊汁稳定性的研究主要集中在优化加工方式[6]、添加稳定剂[7]及探究浊汁浑浊机理[8]等方面，关于苹果自身内源因素（如苹果多酚）对体系稳定性的影响鲜有报道。但苹果中酚类物质的种类及含量会直接影响苹果汁的最终品质（如颜色、稳定性、营养价值等）。梁迪[9]研究发现添加苹果多酚后，苹果果胶溶液的黏度增加，体系稳定性较好。在苹果榨汁过程中，苹果多酚会与果胶接触并产生相互作用[10]，这可能会对果胶结构产生一定影响，最终影响浊汁体系的浑浊稳定性。Bai Xuelian等[11]研究发现原花青素除了增强苹果汁苦味外，还可能与蛋白质、多糖发生相互作用产生絮状物从而导致体系内沉淀的产生。近年来的研究发现多酚与果胶之间存在着共价及非共价相互作用力，且相互作用强度与各自结构、pH值、温度、离子强度等因素有关[12-13]。非共价相互作用的多酚和果胶主要涉及氢键、范德华力、疏水相互作用及静电相互作用，影响食品的感官和营养属性[14-15]；共价相互作用能够通过酶促、碳二亚胺交联及自由基诱导等方法产生[16]。

苹果中酚类化合物主要有表儿茶素、绿原酸、原花青素B2和C1[17]。目前有关原花青素的研究较多，而对于其他多酚作为内源因子与果胶相互作用及其对浊汁体系稳定性的研究鲜见报道。因此本实验选择苹果中常见的3 种多酚：根皮苷（phlorizin，PHL）、绿原酸（chlorogenic acid，CGA）及表儿茶素（epicatechin，EC），根据其在不同产地、品种及成熟度的苹果中的含量确定浓度梯度[18]，模拟浊汁体系中的内源因子。探究不同浓度的3 种多酚对其与苹果果胶（pectin，PT）组成的浊汁复合体系的理化特性及稳定性的影响，为浊汁原料的选取，浊汁体系稳定性的改善提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果PT（APA系列103） 烟台安得利果胶股份有限公司；PHL、CGA、EC 上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-2450紫外分光光度计 日本岛津公司；Spectrun100傅里叶红外光谱仪 美国PerkinElmer公司；ZEN3690激光粒度分析仪 英国马尔文公司；MCR302流变仪 奥地利安东帕公司；SYNERGYH1MG全波长酶标仪 美国基因公司；Phenom Pro扫描电镜 荷兰Phenom Pro公司；TGA550热重分析仪 美国TA公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

将PT、PHL、CGA、EC分别溶解于超纯水中，室温下分散至少2 h。之后将PT分别与不同多酚混合后再分散2 h，静置至少2 h。制成多酚浓度依次为0.03、0.08、0.22、0.42、0.70 mmol/L，PT质量浓度为5 mg/mL的混合体系（混合体系按照多酚浓度增加，以A～E依次编码）。溶液制备后部分存放于-40 ℃冰箱中，部分使用真空冷冻干燥为粉末保存，待用。

1.3.2 紫外光谱测定

移取3 mL待测样品于石英比色皿中，以超纯水作为参比，于室温（25 ℃）检测样品在20～660 nm波长范围内的紫外吸收光谱。

1.3.3 傅里叶变换红外光谱测定

参考Raei等[19]的方法并略有修改。冻干样品与干燥后的KBr以1∶50置于玛瑙研钵中均匀混合研磨，取研磨后样品（每个样品3 份，每份75 mg）烘干后压片进行测量。KBr为扫描背景，扫描范围400～4 000 cm-1，扫描分辨率4 cm-1，累计扫描32 次。

1.3.4 扫描电子显微镜测定

取适量冻干后的样品置于粘台后进行喷金处理，在加速电压10 kV下观察样品的微观结构。

1.3.5 静态流变性质测定

参考Wellala等[6]的方法并略有修改。使用药匙舀取样品，选定cp60-1锥板；扫描温度25 ℃；流动曲线（黏弹性流体、胶体）测定模式；剪切速率变化：0.1～100 s-1。测试完毕后对数据进行数学公式拟合，成功应用于Power-Law方程：

式中：σ为剪切应力/Pa；KPL为稠度系数/（Pa·s）；γ为剪切速率/s-1；n为非牛顿指数。

1.3.6 复合物黏度/温度曲线测定

选定cp60-1锥板；测定模式：旋转模式，温度扫描；平衡温度20 ℃，预剪切3 min，剪切速率10 s-1；数据取点时间：由稳态；剪切速率为恒定值50 s-1；温度为变量，测量25～75 ℃线性变化。测试完毕后对溶液黏度与剪切速率数据进行数学公式拟合，成功应用于果胶-多酚混合溶液的方程为Arrhenius方程：

式中：η为特定温度条件下溶液表观黏度/（mPa·s）；A为频率因子（常数）；Ea为活化能/（kJ/mol）；R为摩尔气体常数（8.31 J/（mol·K））；T为绝对温度/K。

1.3.7 热重曲线测定

取适量冻干样品于石英坩埚中，在氮气环境中进行热重分析，升温速率为10 ℃/min，温度范围为30～800 ℃，系统自动采集数据。

1.3.8 粒径测定

选择纯水作为测量背景，取1 mL待测样品放入激光粒度仪的样品池中进行粒径及分布的检测。动态光散射角度为90°，温度为25 ℃，检测波长为633 nm。

1.3.9 浊度及浊度保留率的测定

将所有样品置于旋涡振荡器中混合振荡均匀，取200 μL于96 孔板中，650 nm波长处测量吸光度，每样一式三份进行测量，吸光度即样品的浊度。

参考托尔坤·买买提[20]的方法并略有修改。浊度保留率即离心后的浊度与离心前的浊度的比值。将各样品分为离心、不离心两部分，离心部分经离心机以3 500 r/min离心15 min，不离心部分相应静置15 min。取不离心各样品以及离心后各样品上清液各200 μL加入96 孔板中，记录在650 nm波长处的吸光度，每个样品平行测量3 次。不离心样品吸光度记为A1，离心样品吸光度记为A2。按照下式计算浊度保留率：

1.4 数据处理

所有实验均重复3 次。利用Origin 8.1软件作图。使用SPSS 19.0软件对数据进行ANOVA差异显著性分析与t检验，使用TRIOS对热重及流变数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 紫外光谱分析

图1 不同浓度PHL、CGA、EC与PT复合体系紫外光谱图Fig.1 UV-vis spectra of composite systems containing PT and PHL,CGA or EC at different concentrations

由图1可知，PT于202 nm波长处存在最大吸收峰，符合果胶多糖的特征吸收峰[21]。在281 nm波长处存在一个微小肩峰，可能是由于选取的商品果胶纯度不足，存在微量杂质所致。PHL属于二氢查尔酮类物质，具有苯环、双键、羰基等不饱和结构，其在284 nm波长处有紫外特征吸收峰[22]；CGA属于羟基肉桂酸衍生物，在300、327 nm波长处出现吸收峰[23]；EC属于单体黄烷醇类，吸收峰约在279.80 nm波长处[24]。可以观察到随着多酚浓度的增加，各谱图多酚对应波长的吸收峰强度逐渐增加，出现轻微位移，表明多酚与果胶之间可能发生了相互作用[23]。PT特征峰吸收强度随着多酚浓度的增加有规律地增强，对应波长存在着不同程度的红移现象，这可能是由于多酚的加入改变了体系极性或在体系内形成了共轭体系所引起[23]。图谱中并未出现新的吸收峰，表明多酚与果胶复合过程中无新的不饱和键生成[22]。

2.2 红外光谱分析

本实验通过红外光谱进行相互作用力的分析，如图2所示，样品具有典型的PT红外谱图特征。在3 000～3 700 cm-1处出现的宽峰是由PT及相应多酚的分子间或分子内的O—H的伸缩振动引起的。2 933 cm-1处的吸收峰由果胶半乳糖醛酸甲酯或CH2基团上的C—H伸缩振动引起[25]。不同样品在此吸收峰处发生不同程度的蓝移现象，表明C—H键参与3 种多酚与果胶的相互作用。1 747 cm-1及1 622 cm-1处的吸收峰分别为PT中酯化羧基C＝O的伸缩振动及未发生酯化的游离羧基的C＝O伸缩振动，可根据这2处的吸收峰计算PT酯化度[26]。由图2可看出，1 747 cm-1处峰明显高于1 622 cm-1，因此样品均为高酯果胶，且可观察到体系中有多酚加入后，酯化度有降低趋势，这与酯化度的测定结果保持一致。1 040～1 060、1 015 cm-1处吸收峰表明复合体系中有阿拉伯糖及糖醛酸存在；740～780 cm-1处的吸收峰表明复合体系是由α-糖苷键连接而成[27]。由红外光谱可知，PT与PHL、CGA及EC之间可能发生了非共价相互作用，其中分子间或分子内氢键、C—H、C＝O键均参与了反应。

图2 不同浓度PHL、CGA、EC与PT复合体系红外光谱图Fig.2 Fourier transform infrared spectra of composite systems containing PT and PHL, CGA or EC at different concentrations

2.3 扫描电镜分析

图3 不同浓度PHL、CGA、EC与PT复合体系扫描电镜图Fig.3 Scanning electron micrographs of composite systems containing PT and PHL, CGA or EC at different concentrations

由图3可知，PT的微观结构整体呈现出板状形态，表面粗糙多孔，有类似蜂窝状的结构穿插其中。与PT相比，PT-PHL复合体系表面较为平滑，随着PHL浓度的增加，体系的整体性降低，出现片状结构构型，这一形貌特征与范新景等[22]的研究结果相似。加入CGA后的复合体系先是变得紧密，表面出现褶皱结构，而当浓度逐渐增大至0.22 mmol/L时，复合体系开始出现片状结构，变得松散，这与本实验中表观黏度的变化一致，可能是由于PT与CGA之间的结合能力有限[28]或是多酚与果胶之间形成了聚合体所致[29]。随着EC的加入，复合体系表面变得光滑，出现片状结构，体系变得松散。根据扫描电镜图可知，多酚的引入会改变果胶原有的网络构象，使得体系的结构发生改变。

2.4 流变学分析

2.4.1 表观黏度分析

图4 不同浓度PHL、CGA、EC与PT复合体系表观黏度图Fig.4 Apparent viscosity versus shear rate curves of composite systems containing PT and PHL, CGA or EC at different concentrations

由图4可知，不同多酚与PT的复合体系均表现出明显的剪切变稀现象，这与梁迪[9]的研究结果一致。在低剪切速率条件下，复合体系的黏度迅速下降，PT是由链状分子构成的大分子聚合物，其分子间会互相缠结形成较大黏度，而随着剪切速率的增大，分子间的缠结作用减弱[27]；在高剪切速率条件下，PT的链状分子因为会受到流层之间的剪切应力作用，分子构象遭到破坏，分子链之间的缠结数量降低，PT分子偏离自身平衡结构，来不及形成新的网络构象，此时黏度对剪切速率的依赖程度较低，复合体系的黏度几乎维持不变或略微下降[30]。此外，图中还可观察到随着剪切速率的增加，各复合体系的剪切应力基本呈现线性增加的趋势，并未出现屈服现象[20]。

表1 PHL、CGA、EC与PT混合体系Power-Law模型拟合参数Table 1 Power-Law model parameters for composite systems containing PT and PHL, CGA or EC at different concentrations

表1为各复合体系样品表观黏度数据拟合情况，其中R2均大于0.99，拟合情况较好。KPL为复合体系的稠度系数，KPL数值越高，表明体系黏度越高。由表1可知，PHL与EC的加入对其与PT组成的复合体系的黏度有轻微影响，但影响并不显著。0.08 mmol/L CGA可以增大复合体系的黏度，其余浓度则未有显著影响，这与扫描电镜在该浓度下变得紧密后逐渐疏松的现象相似，推测CGA浓度为0.08 mmol/L时与PT之间相互作用强度达到最大，之后随浓度增大逐渐降低，可能与多酚与PT疏水相互作用的结合位点数量有关[31]。复合体系的非牛顿指数n值均小于1，表明多酚的引入并未改变体系的流体类型，多酚与果胶相互作用的复合体系较为稳定[32]，所有复合体系均表现出假塑性流体的特征。n值越接近1，体系越接近于牛顿流体。多酚的加入使得体系假塑性流体特征略加强，但大多未达到显著程度，其中0.08 mmol/L CGA能够显著增强体系假塑性。

2.4.2 温度扫描分析

由图5可知，随着温度的上升，复合体系的黏度下降。在25～65 ℃之间，复合体系黏度下降速率较快，表明温度破坏了多酚与果胶的相互作用，可能是破坏了二者之间的氢键相互作用使得复合体系黏度下降[33]。当温度超过65 ℃后，黏度下降速率降低，这可能与分子间疏水相互作用力有关[34]。也可能是温度升高，分子热运动加剧，分子之间的间距变大，削弱了分子之间的氢键相互作用力导致黏度降低[20]。不同浓度多酚与PT复合体系，其黏度变化趋势相似，不同多酚之间有些许差别可能与不同多酚的结构有关，不同结构的多酚携带不同数量的羟基，与果胶之间可形成的氢键相互作用程度不同[16]。

图5 不同PHL、CGA、EC与PT复合体系温度扫描图Fig.5 Temperature-dependent viscosity of composite systems containing PT and PHL, CGA or EC at different concentrations

表2 不同浓度PHL、CGA、EC与PT复合体系Arrhenius方程拟合表Table 2 Arrhenius model parameters for composite systems containing PT and PHL, CGA or EC at different concentrations

由表2可知，数据拟合R2均大于0.940，拟合情况良好。Ea可以反映复合体系对于温度的敏感程度，Ea越高，表明体系内的分子链刚性越强，体系黏度对温度越敏感[35]。理论上，体系对温度越敏感，体系的温度越高，其内部分子热运动越快，分子间的相互作用力就越小[36]。0.03 mmol/L PHL的引入能够降低体系活化能，降低了PT溶液黏度对温度的敏感程度，表明0.03 mmol/L PHL与PT之间的相互作用力在热环境下较为稳定，可能与果胶甲基群和PHL的吡喃杂环（C环）之间形成的疏水相互作用有关[37]。0.08 mmol/L CGA与PT复合体系的活化能较高，黏度对温度较敏感，可能是因为二者之间相互作用（氢键）较强，形成的分子链的钢性较大所致[20]，这也可以解释在该浓度下复合体系黏度的增大。

2.5 热重分析

为了探究不同多酚对复合体系热稳定性的影响，从营养健康及稳定性角度出发，本实验选取最大浓度多酚与果胶形成的复合体系进行热重分析。其中实线为样品的热重图像，反映物质质量随温度的变化，虚线为热重曲线的一阶导数，表明样品质量损失所经过的阶段。由图6及表3可知，多酚与PT的复合体系热损失主要可分为3 个阶段：第1阶段为30～100 ℃，这一阶段主要为自由水的损失，在此阶段样品的质量损失率在8%～12%之间。第2阶段主要发生在100～200 ℃，此时的质量损失主要为体系内结合水及其他挥发性物质的损失，质量损失率为5%～8%。多酚的加入会降低体系的质量损失率，可能是因为多酚与果胶之间形成了氢键，降低了果胶对水的结合作用，使得复合体系内的结合水含量下降[9]。复合体系主要的质量损失发生在第3阶段（200～300 ℃），在此阶段复合体系质量迅速下降，此时主要为果胶受热分解导致的质量快速损失[25]。在多酚的存在下，复合体系在第3阶段的质量损失较PT低，其中0.70 mmol/L EC对复合体系质量损失率的降低程度最大。因此认为多酚能够提高复合体系的热稳定性，这与托尔坤·买买提[20]的实验结果相似。

表3 PHL、CGA、EC与PT复合体系在不同温度范围的质量损失率Table 3 Mass loss rates of composite systems containing PT and PHL,CGA or EC at different concentrations in different temperature ranges

2.6 稳定性分析

2.6.1 粒径分析

图7 不同浓度PHL、CGA、EC与PT复合体系粒径大小Fig.7 Particle sizes of composite systems containing PT and PHL,CGA or EC at different concentrations

由图7可知，相较于PT溶液，3 种多酚均能降低模拟浊汁复合体系的平均粒径大小。其中0.08 mmol/L PHL对体系粒径的降低效果最为显著，由1 365 nm降至1 072 nm。表明多酚的引入可能起到一定的抑制果胶分子自聚集的作用，使得溶质粒子分散更加均匀[27]。随着多酚浓度的上升，溶液粒径呈现略微增加的趋势，可能是PT与多酚之间形成了分子聚集体并发生缠结所致，这与Mamet等[29]的实验结果相似。

2.6.2 浊度及浊度保留率分析

表4显示了不同浓度PHL、CGA、EC与PT复合后体系的浊度变化。由紫外光谱图可知在650 nm波长处果胶与多酚均无吸收峰存在，因此选取650 nm为浊度测量波长。引入不同浓度的PHL、CGA、EC后，体系浊度均有一定程度的下降，其中0.70 mmol/L PHL，0.42 mmol/L CGA以及0.08 mmol/L EC与PT复合体系浊度显著降低。3 种多酚中PHL对体系浊度的影响程度最大，吸光度由0.053 7下降至0.051 0。主要是由于不同结构的多酚与果胶的结合能力不同所致[13]。溶液的浑浊稳定性可用溶液经离心力作用后其浊度保留率来衡量，保留率越大，表明溶液的浑浊稳定性越好。0.03 mmol/L PHL与PT复合体系的浊度保留率有所增加，其余多酚与果胶复合体系的浊度保留率均无显著变化。根据粒径结果可知，当体系内PHL浓度大于0.08 mmol/L时，复合体系的粒径增大，稳定性轻微下降，因此综合得到，0.03mmol/L PHL对复合体系的稳定性维持效果较好。

表4 不同浓度PHL、CGA、EC与PT复合体系浊度及浊度保留率Table 4 Turbidity and turbidity retention of composite systems containing PT and PHL, CGA or EC at different concentrations

3 结 论

不同浓度的PHL、CGA、EC均会对PT的结构产生影响，使得体系表面变得光滑，出现片状结构。3 种多酚与PT之间发生了非共价相互作用，其中分子内、分子间氢键、C—H、C＝O键均参与反应，多酚与PT之间并未生成新的不饱和键。复合体系均为假塑性流体，体系内引入多酚后流体类型不发生改变，3 种多酚均可以提高复合体系的热稳定性，降低其在高温下的质量损失率，降低体系粒径及浊度，CGA、EC对体系的浊度保留率无显著影响。不同多酚与PT的相互作用程度不尽相同，但整体趋势相似。在一定的浓度范围内，3 种多酚均能够增强体系的稳定性，其中PHL与CGA对体系的作用效果强于EC；这与其分子结构，羟基数量及羟基位置有关。多酚对复合体系稳定性的影响与其在复合体系中的浓度并未显现出一定的规律性，其中0.08 mmol/L CGA与PT之间的氢键相互作用力较强，可以增加复合体系的黏度及假塑性，提升复合体系对温度的敏感程度，降低体系粒径；0.03 mmol/L PHL能够降低复合体系的活化能，提高复合体系的浊度保留率，降低体系粒径。从稳定性及相互作用效果综合得到，0.03 mmol/L PHL及0.08 mmol/L CGA对维持复合体系稳定性的效果较好。在后续研究中，可进一步明确这3 种多酚与PT之间的相互作用机制，探究不同多酚浓度及不同结构对相互作用效果的影响，或针对其他内源因子做更深入的研究，为浊汁的原料选择提供依据。