纸基微流控芯片检测方法研究进展*

刘 溢，王 英，姜钰婷，胡 晨，刘春叶，张 剑

(西安医学院 药学院，陕西 西安 710021)

纸基微流控芯片，是一种集成化、便携化、低成本化的检测技术。纸芯片可追溯到17世纪，英国化学家波义耳偶然发现紫罗兰溅到盐酸会变红，由此发明了石蕊试纸。2007年，Whitesides团队首次提出纸基微流控芯片技术的概念，随后纸基微流控芯片已经得到了快速发展。2009年，张钊[1]继2008年美国亚利桑那大学研制出第1张折纸芯片后，开发出新型DNA折纸芯片；2011年，王方方等[2]采用光刻法制备一维和二维纸芯片，验证了纸芯片上化学发光法检测葡萄糖和尿酸的可能性；2012年Maejima Kento[3]等提出了利用喷墨打印技术制作纸芯片，研制出了低成本、可大量生产、能在家进行血液检测的纸芯片；同年，Xie Li等[4]通过喷墨打印电极技术制作出混合可穿戴的生物传感系统，为新一代可穿戴的健康监测技术提供了有力支持；2013年，马翠翠[5]研发出一种基于紫外光降解自组装单分子层的纸芯片新型加工法；同年，寇娟[6]提出用鲁米诺-过氧化氢化学发光体系测定药物，严伟等[7]利用微流控纸芯片研究乳腺癌组织；2014年，贵金属及其氧化物的纳米材料开始广泛运用于纸芯片的制作与检验[8-11]；2015～2016年纸芯片的新型制作方法层出不穷[12-16]，如回形针固定法、3D打印法、离子体法等；2017～2020年人们开始关注纸芯片与智能手机的结合[17-19]以及如何进一步提高检测精度与速度[20-22]等问题。

现如今，纸基微流控芯片已广泛运用于食品安全检测[23-27]、医药[28-33]、环境检测[34]等各领域。相比较于其他方法，纸芯片具有可大规模生产、易于携带、检测迅速、不需要专业人员、大型配套设施分析，结果分明可直接观察等突出优势。

1 纸基微流控芯片的检测方法

目前，纸芯片的发展已较成熟，检测方法众多，但应用最广泛的大致有比色法、荧光法、化学发光法、电化学法4种。

1.1 比色法

比色法是将检测对象加入到检测体系，构建相关的显色反应进行检测的，通过显色时间、体系pH值、检测温度、物质浓度等因素来衡量检测的有效程度。实际操作中，通常都会使用纯化、富集或浓缩后的检测溶液或根据实际情况加入显色剂，以达到更理想的比色效果。

1.1.1 食品安全检测

食品安全问题一直都是热点，将比色法用于食品检测大大增加了检测的便利性和实用性。吕聪聪等[35]利用三聚氰胺对H2O2的催化作用，使辣根过氧化氢酶-3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(HRP-TMB)-H2O2体系在同一时间颜色加深，通过观察紫外可见吸收曲线测定出三聚氰胺的检出限为5 μmol/L；张一冉等[36]通过挑选出9种对三甲胺灵敏的指示剂，制作出气敏纸芯片，对不同时期鲈鱼肉的挥发性气体进行检测，成功辨别出不同储存时间段的鲈鱼肉；Lung-ming Fu等[37]利用热塑性聚酯纸芯片和SO2发生酸碱反应，通过高分辨率的相机和红绿蓝(RGB)分析软件检测分析，结果表明食物中φ(SO2)=10×10-6～300×10-6，φ(SO2)与RGB色度值具有很高的线性关系(R2=0.998 1)，该结果与传统方法的偏差小于3.82%。

1.1.2 蛋白质检测

蛋白质的检测在食品、医药领域都很重要，采用比色法的优点在于该方法操作简单，可进一步推行到日常生活中。李秀平[38]等通过紫外光刻技术制作纸芯片，利用体积为0.2 μL、质量浓度为10 mg/mL的溴酚蓝作为指示剂检测尿液中总蛋白含量，检测时间控制在5 min以内，经过量化由显微镜电荷耦合器件(CCD)拍摄芯片图像的灰度用来执行半定量，检测限为2.1 mg/L,定量限为6.9 mg/L，回收率为96.7%～103.82%。

1.2 荧光法

荧光法利用检测对象与相应的荧光材料作用产生荧光，运用荧光光谱法、荧光光度法等进行定量分析，是目前使用最广泛的一种检测方法。同时，荧光法与液相色谱法的结合能进一步精确实验数据，也为荧光法的运用带来更多可能性。

1.2.1 重金属检测

随着人类活动的扩大，食物、环境中的重金属含量增加，有效检测重金属，确保人类健康生活这一问题在生活中日渐突出，采用荧光法检测重金属是很好的选择。孙觅觅[39]基于紫脲酸铵(Mu)与镉离子相互作用产生紫外可见光谱的变化，检测出镉离子检测范围为0～35 μmol/L，紫外检测限为0.21 μmol/L,并成功用于大米中镉离子的检测；陈绮娴[40]以盐酸多巴胺为碳源，邻苯二胺为修饰剂将荧光碳纳米材料与纸芯片结合，发现该材料对Hg2+具有高选择性，ρ(Hg2+)=0.04～0.610 μg/mL，对Hg2+表现出良好的线性响应,检出限低至0.000 6 μg/mL(S/N=3，n=6)；王冠等[41]以玻璃纤维纸为基体，碲化镉量子点为荧光响应材料，3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)为单体，正硅酸四乙酯(TEOS)为交联剂在玻璃纸表面分别合成镉和铅离子印迹聚合物，检测出镉离子的线性范围为0.05～80.0 μg/L,检出限为0.01 μg/L；铅离子的线性范围为0.10～78.0 μg/L，检出限为0.03 μg/L。实际样品检测的回收率分别为98.0%～104.0%和99.4%～103.4%；Junrui Zhou等[42]首次利用离子印刷技术将新型荧光量子点ZnSe应用于3D纸基微流控芯片，用来单独或同时检测镉离子和铅离子。检测出该纸芯片对镉离子的检测范围为1～70 μg/L，最低限为0.245 μg/L；铅离子的检测范围为1～60 μg/L，最低限为0.335 μg/L。

1.2.2 蛋白质检测

同样，荧光法也可用于蛋白质的检测。郭小艳[43]利用纸芯片免疫分析方法检测免疫球蛋白，采用顺序喷墨打印技术测定免疫球蛋白(IgG)的检出限为0.4 ng/mL；陈莹[44]利用量子点信号标记物实现了对癌胚抗原(CEA)和前列腺蛋白(PSA)的检测，测定出线性范围分别为1.0～40.0 ng/mL和1.0～45.0 ng/mL，检出限分别为0.3 ng/mL和0.4 ng/mL。

1.2.3 农药检测

农业生产上使用农药，在一定程度上提高了农产品的产量，但是超标的农药残留同样对环境、人体有不同程度的危害，所以应该密切关注农产品中农药的残留量。杨铖[45]将能识别目标农药的适配体与基于荧光内滤效应(IFE)的金纳米(AuNPs)-量子点(CdTe QDs)体系相结合，并与最优的混合区通道组合，检测出该系统对啶虫脒的检测范围为50～600 μg/kg；对丙溴磷的检测范围为60～480 μg/kg，均低于国标中的农药最大残留限量。

1.3 化学发光法

化学发光法是检测对象与检测体系之间经过反应发光，通过分析发光时间、发光强度等因素得出检测结论的一种方法。采用化学发光法，要合理选择背景，通过优化各项条件使发光强度稳定，发光时间便于检测，减少干扰。临床上利用化学发光法检测肿瘤、病毒等效果大多优于放射免疫法、酶联免疫法。目前已有公司利用化学发光法制作试剂盒来检测新冠肺炎病毒。

1.3.1 蛋白质检测

化学发光法检测蛋白质常用于医疗领域，该方法具有较高的精确性。于丽娟[46]基于甲胎蛋白上所标记的辣根过氧化物酶(HRP)能催化鲁米诺-过氧化氢化学发光体系发光，通过分析发光强度与甲胎蛋白(AFP)浓度的关系，检测出了实际血清中的AFP；刘蒙蒙[47]基于血红蛋白质和肌红蛋白质都含有血红素分子，能作为催化剂使鲁米诺-过氧化氢体系发光，实现了对蛋白质定性低检测限的分析。

1.3.2 化学物质检测

Hideyuki Matsuura等[48]利用喷蜡打印法将发光的报告蛋白固定在纸芯片上一排反应圈中，该纸芯片能用于人全血中氨基糖苷类物质的检测，利用样品检测的数码相机检测发光信号，检测结果在30～60 min呈现。该芯片为氨基糖苷类药物抗生素的检测治疗提供了新思路，适用于不发达地区。

1.4 电化学法

电化学法是通过在纸芯片上建立电极，检测样品加入时能产生电流，在相关检测仪器的处理下分析出结果的方法。该方法具有较高的灵敏度，能进行高质量的检测，同时设计纸芯片时通常考虑电极材料、电压大小、反应时间、溶剂配比、样品添加量等常见因素，制作思路较清晰。

1.4.1 离子检测

离子的检测不同于其他化合物较简单的检测，目前人们大多从离子带电这一角度入手，采用电化学法进行检测。于涵等[49]通过滴涂导电碳浆及Ag/AgCl浆，分别制备了固态聚合物膜钙离子选择性指示电极和固态聚合物膜参比电极，用于海水中Ca2+的检测，结果为在0.5 mol/L NaCl背景下，该系统在c(Ca2+)=1.0×10-4～3×10-2mol/L呈现线性响应,响应斜率为24.3 mV/dec；温雪飞[50]利用离子溅射仪在铜版纸表面电沉积金，再在铜版纸(Au/paper)电极表面修饰多壁碳纳米管(MWCNTs)，加热烘干后制得MWCNTs/Au/paper工作电极，实现了对塑料样品中重金属铬和二酚基丙烷的检测；Wang Xiaoqing等[51]利用磁控溅射法在硝化纤维纸上构建出了一个三电极系统，利用方波溶出伏安法检测Cu2+，在ρ(Cu2+)=5～200 μg/L、200～1 000 μg/L显示出99.58%和98.87%的良好线性，该方法检测最低限为2 μg/L，同时也适用于Zn2+、Cd2+、Pd2+、Bi3+等离子的检测。

1.4.2 化学物质的检测

电化学法也能根据实际情况用于其他化合物的检测。Dhouha jemmeli等[52]利用炭黑修饰的墨水制作出的纳米纸芯片对双酚A有高度敏感性，通过方波伏安法，检测出河水以及饮用水中的双酚A含量均符合相关标准；杨文韬等[53]研发出一种基于浓差电池原理的纸芯片，通过与智能手机的结合实现了对三氯磷酸酯的快捷、可自供电的定量检测，检出限为0.89 μmol/L。

1.5 电化学发光法

电化学发光法是电化学法和化学发光法的结合，使结果更明显的同时也能适用于平时检测难度较大的对象，目前使用电化学发光法的资料较少，该方法也因此具有巨大潜力。王嘉伟[54]研制出一种在纸基上进行的酶催化反应，结合智能手机作为检测的新型电化学发光系统，可用于经济不发达地区人民健康检测；Yu Chen等[55]研发出一种基于电化学发光法通过生物传感器检测乙肝表面抗体的纸芯片，利用循环伏安法和电化学发光法，得出线性范围为34.2 pg/mL～34.2 ng/mL，该纸芯片相比于其他方法具有更高的选择性和敏感性。

1.6 其他方法

1.6.1 光电检测法

近年来光电检测法也逐渐适用于纸芯片，该方法通常结合其他检测方法一起使用，也为纸芯片后续的检测提供了新思路。杨宁[56]等通过构造桥式复合结构提升微流控酶抑制显色反应的均匀度，设计出集化学反应、光吸收反射效应和环境参数控制于一体的农药检测系统，该方法分辨率达0.002 mg/L，与YPS-1168型便携式农药检测仪检出限相当，但试剂消耗价格降低了94.79%，时间缩短了23%；李振[57]基于酶抑制生化反应在纸基微流控芯片上检测的基本原理，引入反射式光电检测和荧光光电检测技术，在进行了信息采集、公式采集、误差分析之后，运用反射式光电检测的纸基微流控芯片(RPPMC)法和面向荧光检测的纸基微流控芯片(FPMC)法分别检测敌百虫时对应的相关系数为0.982和0.996，检出限为0.010和0.007 mg/L；检测对硫磷时对应的相关系数为0.984和0.978，检出限为0.014和0.012 mg/L。

1.6.2 一体化检测模型

传统纸芯片检测方法分为检测和分析2个步骤，一体化检测模型借助于不同仪器将检测和分析过程一次完成，提高了纸芯片的简便性。Ruey-Jen Yang等[58]基于3D纸基微流控芯片制作出一种新型一体化检测模型，用于检测人全血样品中白蛋白的浓度。检测时首先在纸芯片检测区域添加溴甲酚绿(BCG)，并将该模型储存在15 ℃的氮气环境中；然后加入10 μL全血样品，样品会与BCG反应，加热使温度上升至37 ℃，反应时间为6 min。结果表明，模型分析结果与标准结果(R2=0.983 7和R2=0.996 8)一致，该一体化模型可用于白蛋白的快速检测。

综合比较以上方法，可总结出纸芯片常用4种方法的特点，见表1。

表1 纸芯片常用4种检测方法的特点

2 结束语

纸芯片因其具有低成本、便携性、检测快速、结果分明、无需高端检测设备与技术人员等优点可大量运用于不发达地区以及日常生活中。在纸芯片的检测方法中，比色法、荧光法、化学发光法操作简单，结果易分辨，适用于日常检测及自我检测；电化学法制备纸芯片有一定难度，使用受限，需要相关仪器配合使用，通常用于专业性的离子检测。纸芯片在医疗方面的疾病诊断、药物含量检测、食品安全方面的有害物质检测、环境方面的污染物检测等有很大的应用前景。

随着社会需求的变化，关于优化纸芯片检测，应该考虑设计出更加灵敏、一体化、多功能、有效期长、便于储存的纸芯片。还可以考虑能否用纸芯片代替更多传统的检测，特别是在疾病检测，健康保健方面可加强与智能手机的联系，将纸芯片推广进日常生活中，为人们带来更多便利。