HNF-4α基因多态性与非酒精性脂肪性肝病的关系

黄海燕，李毅，吕其军，周芳，王济红，杨长春，徐娟△

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）属一种临床病理综合征，主要病理特征是肝实质细胞发生脂肪变性，甚至坏死、脂肪贮积及炎性细胞浸润等［1-2］。NAFLD作为代谢综合征在肝脏的表现，单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎及与其有关的肝硬化或肝癌等均属该病的疾病谱［3-4］。NAFLD可引起多种并发症，如动脉粥样硬化、2型糖尿病等［5］。其发病与环境、遗传等多种因素有关。肝细胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4，HNF-4α）可调节肝脏多个脂代谢的通路［6］，在NAFLD中的作用逐渐成为研究热点，但目前关于HNF-4α基因多态性与NAFLD的关系鲜有报道。本文以NAFLD患者为研究对象，分析HNF-4α基因多态性与NAFLD的关系，以期为探究NAFLD发病的遗传学因素提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2018年10月—2019年4月胜利油田中心医院收治的NAFLD患者为研究对象。纳入标准：符合《NAFLD诊疗指南（2010版）》相关临床诊断标准［7］；年龄18~75岁；无大量或长期饮酒史（饮酒换算乙醇量：女性＜70 g/周、男性＜140 g/周），均为非酒精性单纯性脂肪肝；精神状态尚可、意识清晰，可配合研究。排除标准：合并恶性肿瘤；合并心、肺、肾等其他重要器官的功能损伤；伴有病毒性肝炎、自身免疫性肝病、药物性肝病、肝豆状核变性等；伴发感染性疾病、传染性疾病、免疫性疾病、内分泌疾病等；处于妊娠期或哺乳期；近3个月服用可影响内分泌的药物。根据上述标准，共纳入100例NAFLD患者作为观察组。选择同时期来本院查体的100例健康人作为对照组。本研究已通过医院医学伦理委员会的审查，研究对象均签署知情同意书。

1.2 资料收集 收集研究对象的一般临床资料，包括年龄、性别、身高、体质量、体质量指数（BMI）、收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、腰围、臀围、腰臀比（WHR），以及肝功能［丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）］、血脂［三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）］、血糖（GLU）、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）、尿酸（UA）等生化指标，检测非酒精性单纯性脂肪肝严重程度和HNF-4α的基因多态性。

1.3 检测方法与分组（1）非酒精性单纯性脂肪肝严重程度。行腹部CT，观察病变程度，肝/脾CT比值≤0.5为重度病变，0.5＜肝/脾CT比值≤0.7为中度病变，0.7＜肝/脾CT比值＜1.0为轻度病变。据此，将观察组分为轻度组（28例）、中度组（36例）和重度组（36例）。（2）HNF-4αrs4812829位点基因多态性。使用含乙二胺四乙酸（EDTA）的采血管采集研究对象的外周静脉血5 mL，十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取外周血内单个核细胞基因组DNA。HNF-4α基因上游引物为5'-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGC⁃GACTCTCCAAAACCCCT-3'，下游引 物为5'-TCCTTG⁃TAGTCCATACCGATAACTTCCTGCTTGGTGATG-3'，PCR的扩增体系包含2 U热启动混合Taq酶、200 ng DNA模板、正反向引物各5µL（10 mmol/L）、5µL dNTPs（200µmol/L）、5µL Tris-HCl（100 mmol/L）、5µL KCl（500 mmol/L）、5µL MgCl2（215 mmol/L），并加去离子水至体积为50µL。在热循环仪上展开聚合酶链式反应（PCR）扩增，条件及过程为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸45 s，循环35次；最后72℃延伸10 min。PCR产物纯化后，37℃条件下采用限制性内切酶消化12 h，将16.5µL酶切产物放入含4%琼脂糖凝胶内，进行电泳分离并明确基因型。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0对数据进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，多重比较采用SNK-q检验；计数资料采用例（%）表示，组间比较采用χ2检验；基因型数据进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，NAFLD发病风险采用多因素Logistic回归分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组与观察组基线资料比较 2组性别、年龄差异无统计学意义，观察组SBP、DBP、BMI、WHR均明显高于对照组（P＜0.05），见表1。

Tab.1 Comparison of general data between control group and observation group表1 对照组与观察组基线资料比较（n=100）

2.2 对照组与观察组各亚组肝功能、血脂、血糖、UA水平比较 对照组、轻度组、中度组、重度组的ALT、AST、γ-GT、TC、TG、LDL-C、GLU、HOMA-IR及UA水平大体呈现依次升高趋势（P＜0.05），而HDL-C水平呈下降趋势，见表2。

Tab.2 Comparison of liver function,blood lipid,blood glucose and UA levels between control group and different subgroups of the observation group表2 对照组与观察组各亚组肝功能、血脂、血糖、UA水平比较 （±s）

Tab.2 Comparison of liver function,blood lipid,blood glucose and UA levels between control group and different subgroups of the observation group表2 对照组与观察组各亚组肝功能、血脂、血糖、UA水平比较 （±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与轻度组比较，c与中度组比较，P＜0.05

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2.3 对照组与观察组HNF-4αrs4812829等位基因及基因型分布比较 HNF-4α基因rs4812829位点多态性在对照组与观察组中的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡规律（P＞0.05），2组均有较好群体代表性，且2组HNF-4αrs4812829等位基因及基因型分布差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3。

Tab.3 Comparison of allele and genotype distribution of HNF-4αrs4812829 between control group and observation group表3 对照组与观察组HNF-4αrs4812829等位基因及基因型分布比较 （n=100）

2.4 观察组不同亚组HNF-4αrs4812829等位基因及基因型分布比较 观察组不同亚组HNF-4α rs4812829等位基因及基因型分布差异均无统计学意义（P＞0.05），见表4。

Tab.4 Comparison of allele and genotype distribution of HNF-4αrs4812829 in different subgroups of the observation group表4 观察组中不同亚组HNF-4αrs4812829等位基因及基因型分布比较

2.5 观察组HNF-4αrs4812829位点不同等位基因携带者之间肝功能、血脂、血糖、UA水平比较 观察组AA、AG、GG型基因携带者之间ALT、AST、γ-GT、TC、TG、HDL-C、LDL-C、GLU、HOMA-IR及UA水平差异均无统计学意义（P＞0.05），见表5。

Tab.5 Comparison of liver function,blood lipid,blood glucose and uric acid levels of HNF-4αrs4812829 locus carriers in the observation group表5 观察组HNF-4αrs4812829位点不同等位基因携带者肝功能、血脂、血糖、UA水平比较 （±s）

Tab.5 Comparison of liver function,blood lipid,blood glucose and uric acid levels of HNF-4αrs4812829 locus carriers in the observation group表5 观察组HNF-4αrs4812829位点不同等位基因携带者肝功能、血脂、血糖、UA水平比较 （±s）

均P＞0.05

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2.6 HNF-4αrs4812829基因位点与NAFLD发病风险的关系 以是否发生NAFLD（是=1，否=0）为因变量，以性别、年龄、rs4812829基因型（GG=0，AG=1，AA=2）等为自变量，对2组性别、年龄等因素校正后进行Logistic回归分析。结果显示，与基因型为GG个体相比，基因型为AG、AA的个体发生NAFLD的风险均未增加，见表6。

Tab.6 Correlation analysis of HNF-4αrs4812829 gene locus and the risk of NAFLD表6 HNF-4αrs4812829基因位点与NAFLD发病风险的关联

3 讨论

3.1 NAFLD的临床特征 NAFLD已成为我国第二大肝病，其发病率仅次于慢性病毒性肝炎［8］。据统计，西方国家NAFLD发病率约30%，其发生与代谢功能障碍机制存在密切联系［9-10］。有研究发现，随着高脂血症、2型糖尿病等代谢性疾病增多，该病发病率明显升高［11］；且NAFLD易引发肝硬化、不良心血管事件等，具有较高的死亡率［12-13］。本研究发现，观察组SBP、DBP、BMI、WHR均明显高于正常对照组，且肝功能、血脂、血糖、UA等指标均明显异于对照组，病情越重，上述代谢指标越差。由此可见，NAFLD患者存在多种代谢紊乱，肝功能下降、血脂及血糖代谢异常。

3.2 HNF-4α在NAFLD发病中的作用 NAFLD发病机制未有明确定论，可能与环境因素、遗传因素等相互作用相关［14］。近年来NAFLD发病的遗传学研究较多，多种核受体、转录调控因子等参与其发病过程［15-16］。其中，HNF-4α作为锌指蛋白的一种，属于核受体超级家族的孤儿核受体，HNF-4α编码基因位于20号染色体的长臂，以同源二聚体形式结合DNA，且其主要在肝脏表达，而在肾脏、胰腺等组织少量表达。HNF-4α参与葡萄糖、脂肪酸、胆固醇等物质代谢过程，参与肝脏的糖异生激活、调节胰岛细胞分泌、调节脂蛋白等相关基因表达［17］。HNF-4α基因rs4812829（G＞A）位点是糖尿病的易感性位点，与迟发性糖尿病或2型糖尿病的发生相关，在调节体内脂质稳态、胆汁酸合成等过程中，HNF-4α亦发挥重要作用。本研究发现，观察组HNF-4α rs4812829位点基因型AA、AG、GG的分布及等位基因A、G的占比均与对照组无明显差异，且HNF-4α rs4812829位点各基因型及等位基因的分布在观察组各亚组之间亦无明显差异，对比观察组HNF-4α rs4812829位点不同基因型携带者之间肝功能、血脂、血糖、UA水平亦均无明显差异，可见HNF-4α rs4812829位点与NAFLD的发生无明显关系。Logistic回归进一步分析发现，与基因型为GG个体相比，基因型为AG、AA的个体发生NAFLD的风险均未增加，推测HNF-4αrs4812829位点的基因多态性尚未增加NAFLD的患病风险。

综上所述，HNF-4α基因rs4812829位点多态性及等位基因的分布与NAFLD发生无明显相关。但本研究仅对NAFLD患者进行血生化指标、CT影像学等检查，且整体样本量偏小，故而有待扩大样本深入研究HNF-4α基因多态性与NAFLD的关系，为预防NAFLD发生提供科学依据。