过表达精神分裂断裂基因1对APP/PS1转基因阿尔茨海默病小鼠突触可塑性及学习记忆能力的改善

王兆涛 徐如祥 马全红 王业忠 姬云翔

1广州医科大学附属第二医院神经外科（广州510260）；2四川省人民医院神经外科（成都610072）；3苏州大学神经科学研究所（江苏苏州215123）

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是中枢神经系统最常见的退行性病变［1］。脑内Aβ斑块的形成是AD 最主要的病理特征之一，其最终将导致神经元突触丧失，影响AD 患者的学习和记忆能力［2-4］。因此，针对减少Aβ和神经元突触的丧失是一种治疗AD 的有效方式［5］。研究表明：AD 是一种基因异质性疾病，涉及多种分子的调控和信号通路的改变［4，6-9］。精神分裂断裂基因1（DISC1）最早被发现于家族性精神分裂病中，现已被证明是多种神经和精神疾病的遗传危险因子。近年来，越来越多的临床数据证明，DISC1 与AD 的发病存在相关性［10］。但关于DISC1 在AD 发病中的机制的报道仍十分罕见。APP/PS1小鼠是最常用的研究AD的模型小鼠之一，随着年龄增长，此小鼠脑内逐渐产生Aβ斑块。因此，本研究将利用小鼠原代神经元和APP/PS1 的AD 小鼠模型，通过过表达DISC1，探索DISC1 对AD 突触丧失和Aβ斑块生成的作用，同时探索其对小鼠学习记忆能力的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物APP/PS1转基因小鼠及其同窝对照C57BL/6J小鼠购自南京大学模式生物研究所。

1.1.2 脑组织样本AD 患者和年龄匹配的非AD患者的脑样本受赠于美国凯斯西储大学。所有患者均由神经科医生诊断，验尸死亡后3 ～21 h 收集大脑样本。

1.1.3 主要试剂高糖DMEM 培养基、10%胎牛血清、B27、bFGF、EGF、胰蛋白酶、青链双抗、鼠抗Aβ抗体、兔抗人DISC1 抗体、鼠抗人GAPDH 单克隆抗体（美国赛默飞公司），Aβ肽（美国Abcam 公司）。DISC1 慢病毒及腺相关病毒由上海和元生物技术有限公司构建。

1.2 方法

1.2.1 实验分组体外培养野生型C57 胎鼠神经元，分为GFP 组（转染GFP 对照病毒）、GFP+Aβ组（转染GFP 对照病毒后进行Aβ处理）、DISC1 + Aβ组（转染DISC1 过表达病毒后进行Aβ处理），每组重复5 次，检测神经元树突棘情况；取2月龄的C57 小鼠，立体定向海马分别注射GFP 对照病毒和DISC1 过表达病毒，随后切脑片，Aβ处理后分成3 组，即对照组（立体定向海马注射GFP 对照病毒）、Aβ处理组（立体定向海马注射GFP 对照病毒后用Aβ处理）、DISC1+Aβ处理组，每组5 只，使用膜片钳技术检测各组的长时程增强（LTP）；C57 小鼠分为WT+GFP 组（野生型小鼠海马注射GFP 对照病毒）、TG+GFP 组（APP/PS1 小鼠海马注射GFP对照病毒）、TG+DISC1 组（APP/PS1 小鼠海马注射DISC1 过表达病毒）三组，每组5 只，免疫荧光染色检测小鼠脑中Aβ斑块沉积，Morris 水迷宫检测各组小鼠学习能力。

1.2.2 Western blot用1×RIPA裂解液（加入1×蛋白酶抑制剂，康为世纪，中国）裂解脑组织。测定蛋白浓度，根据蛋白浓度上样，每孔上样30 μg。通过10%SDS⁃PAGE 凝胶电泳分离蛋白质样品，并通过转移缓冲液将蛋白转移到PVDF 膜上。 然后在室温下用含有5%BSA 的1×TBST 封闭膜1 h，然后在用5%BSA（1×TBST）稀释的一抗（1∶1 000）中4 ℃孵育过夜。之后，将膜与过氧化物酶偶联的二抗（1×TBST 溶液中1∶10 000 稀释）孵育1 h。随后1×TBST 洗膜，3 次5 min。最后使用ECL 化学发光法（Merck millipore，德国）检测，使用Image⁃pro plus计算条带的灰度。

1.2.3 胎鼠原代神经元分离培养分离胚胎14 ～16 d 的小鼠海马和皮层，用含0.01% DnaseI 的0.25%的胰酶在37 ℃消化10 min。组织块转到含10%胎牛血清的DMEM 中，吹打、离心、重悬后，将细胞种在多聚赖氨酸包被的孔板中。细胞培养液为含有B27 的Neurobasal Medium。细胞接种24 h后，用3 × 10-7M 的阿糖胞苷处理细胞抑制胶质细胞生长。

1.2.4 Aβ寡聚体的制备和Aβ处理Aβ42 是所有Aβ中毒性最大的，寡聚化的Aβ42 具有更高的毒性，用Aβ42 寡聚体处理体外细胞可以很好的模拟Aβ 在体内的毒性效应。Aβ 寡聚体的制备：在室温下将1.0 mg 人工合成的Aβ42 在六氟异丙醇（HFIP）中溶解至1 mmol/L，孵育60 min。在Speed Vac（Sc110 Savant Instruments）中真空除去HFIP，并将冻干的肽膜在-20 ℃下干燥储存。然后用DMSO将干燥的肽膜溶解至5 mmol/L 作为贮存液。最后，将储备溶液用PBS 进一步稀释至1 μmol/L 作为最终浓度，将其在37 ℃下培养5 d 以获得成熟的寡聚体。Aβ处理：将制备好的寡聚体加入培养基中，使寡聚体的浓度为10 μmol/L，继续培养一定时间。

1.2.5 树突棘密度分析小鼠元代神经元培养14 d 后，用GFP 对照慢病毒或DISC1 过表达慢病毒感染神经元。将病毒感染的神经元培养1 周，并用1 μmol/L Aβ42 寡聚物或DMSO 处理12 h。然后用4%多聚甲醛固定细胞，并通过激光共聚焦显微镜获取图像。然后将图像输入到Image Pro⁃Plus 软件中，计算每单位长度树突棘的数量。

1.2.6 小鼠海马立体定向注射小鼠异氟烷麻醉后固定在立体定位架上，将小鼠头皮肤切开，用小鼠颅骨磨钻在颅骨上钻一小孔，用10 μL 规格的针以0.2 μL/ min 的速率将2 μL 病毒悬浮液注射到小鼠双侧海马中（定位点：前囟点后2.1 mmol/L，前囟点两侧±1.8 mmol/L，向下1.8 mmol/L）。 注射后，将针再放置5 min，然后缓慢取出。

1.2.7 膜片钳检测小鼠海马LTP使用振动切片机（Leica VT1200S）从切除的小鼠脑制备横向海马切片（400 μm）。在室温下将切片保持在用95%O2和5%CO2鼓泡的人工脑脊液中至少1 h，然后移至浸入式记录室，该浸没式记录室以1e2mL/min 的速率连续灌注氧合脑脊液。通过填充有3 mol/L NaCl 的玻璃微电极（Frederick Haer Co）在海马DG区的分子层中记录兴奋性突触后电位（fEPSP）。将刺激和记录电极置于齿状回的分子层中。调整选择用于基线测量的刺激脉冲（0.2 ms 持续时间，0.033 Hz）以产生其最大斜率的40%。在基线反应稳定30 min 后，使用高频刺激诱导长时程增强（LTP，5 个100 Hz 和1 s 列车间隔20 s）。用Axon multiclamp 700B 放大器获得电生理学数据，以0.1e5KHz 过滤，并以10 KHz 数字化，并使用pClamp10.3软件（Molecular Devices Corp，USA）离线测量和分析fEPSP 的斜率。对照培养基含有：120 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L KCl、1.25 mmol/L NaH2PO4、26 mmol/L NaHCO3、1.3 mmol/L MgSO4、2.5 mmol/L CaCl2、10 mmol/L d⁃葡萄糖，所有溶液均含有100 μm 印防己毒素（Sigma，St.Louis，MO）。

1.2.8 Morris 水迷宫实验小鼠每天给予4 个测试。每次测试由不同的位置开始。每个测试的时间为90 s。连续5 d 记录小鼠的逃离潜伏期（从起始点到目的平台游泳所需的时间）、路径（从起始点到目的平台的游泳轨迹）。第6 天撤掉平台，记录小鼠穿过原平台所在位置的次数，评价检测小鼠的空间学习记忆能力。

1.2.9 免疫荧光染色检测Aβ斑块沉积提取小鼠脑组织于4%多聚甲醛中固定，常规脱水包埋制备切片，切片经清洗、血清封闭。一抗（Aβ抗体，1∶1 000）4 ℃孵育过夜。滴加荧光二抗，室温孵育1 h。DAPI 复染细胞核。荧光显微镜观察并拍照。用Image⁃Pro Plus 图像分析软件分别测定每张切片Aβ斑块的面积。

1.3 统计学方法实验数据应用SPSS 20.0 软件进行统计。计量资料以均数±标准差表示，比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD 方法，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DISC1 在AD 患者脑皮层中表达与年龄相匹配的非AD 患者相比，AD 患者皮层中100 ～130 kDa的DISC1亚型水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 DISC1 在人脑中的表达情况Fig.1 Expression of DISC1 in the human brains

2.2 过表达DISC1 对突触可塑性的影响与GFP组比较，GFP+Aβ组树突棘数量减少，而DISC1+Aβ组较GFP+Aβ组树突棘数量增多，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2A、B。长时程增强（LTP）是突触传递功能可塑性的重要评价指标。对海马注射GFP 对照慢病毒及DISC1 过表达慢病毒的脑切片进行Aβ处理，膜片钳检测其LTP。结果显示，GFP+Aβ组小鼠脑切片的LTP 较GFP 组减弱，而过表达DISC1 后再行Aβ处理，LTP 较Aβ+GFP 组增强，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2C、D。以上结果表明：DISC1 减弱了Aβ诱发的树突棘丧失及对突触可塑性的毒性作用。

2.3 过表达DISC1 对APP/PS1 转基因小鼠脑内Aβ斑块沉积的影响在8月龄的APP/PS1 小鼠海马中注射GFP 对照及DISC1 过表达腺相关病毒，6 个月后，免疫荧光染色检测各组小鼠脑皮层及海马Aβ斑块沉积情况。与TG+GFP 组比较，TG+DISC1组小鼠海马老年斑面积明显减少（P＜0.05），而两组皮层的老年斑面积差异无统计学意义（P＞0.05），表明过表达DISC1 能改善APP/PS1 转基因小鼠脑内Aβ斑块的沉积。见图3。

图2 过表达DISC1 对突触可塑性的影响Fig.2 Effects of overexpression of DISC1 on synaptic plasticity

图3 过表达DISC1 对APP/PS1 小鼠海马Aβ斑块沉积的影响Fig.3 Effects of overexpression of DISC1 on Aβ plaque deposition in APP/PS1 transgenic mice

2.4 过表达DISC1 对APP/PS1 转基因小鼠的学习记忆能力的影响在8月龄的APP/PS1 小鼠海马中注射GFP 对照及DISC1 过表达腺相关病毒，6 个月后使用Morris 水迷宫评价各组小鼠学习记忆能力。各组小鼠寻找平台逃避潜伏期随着时间的延长逐渐缩短。在第5 天时，与WT + GFP 组比较，TG + GFP 组的逃避潜伏期更长（P＜0.05），而TG+DISC1 过表达组较TG+GFP 组的逃避潜伏期缩短（P＜0.05）；同时在撤掉平台后，与WT+GFP组比较，TG+GFP组穿越平台的次数更少（P＜0.05），而TG + DISC1 过表达组较TG + GFP 组穿越平台的次数多（P＜0.05），表明过表达DISC1 改善了APP/PS1 转基因小鼠的学习记忆能力。见图4。

3 讨论

AD 是最常见的神经系统退行性疾病，主要表现为进行性的认知功能缺陷和行为能力障碍，严重影响患者日常生活水平，本病从明确诊断到患者死亡通常只有3 ～9年的时间。目前全球有超过5 000 万AD 患者，而且患者数量还在不断增加，给社会和家庭带来沉重的经济负担［11］。随着人口老龄化的不断加剧，AD 的发病率越来越高［1］。AD 病因复杂，且目前没有确切的治疗方法。因此，亟需探索其发病机制并寻找有效的治疗方法。

图4 Morris 水迷宫实验检测过表达DISC1 对APP/PS1 转基因小鼠学习能力的影响Fig.4 Effects of overexpression of DISC1 on Morris water maze experiment in APP/PS1 transgenic mice

目前AD 的发病机制仍未完全阐明，其发病涉及多种分子的改变。以往的研究发现，DISC1 是包括精神分裂症、重性抑郁和双相精神障碍在内的多种精神疾病的遗传风险基因［12-15］。最近几年，DISC1 与AD 发病的关系越来越受到关注：ZHANG等［10］报道DISC1 与中国北方汉族AD 的发病存在相关性；SHAHANI 等［16］报道DISC1 可以调控淀粉蛋白前体APP 在细胞内的转运；并且先前实验也证实，DISC1 在8 个月的AD 小鼠脑中低表达［17-18］。由于存在可变剪接，DISC1 具有多种亚型。 在蛋白质水平上，检测到的大多数DISC1 亚型在100 ～130 kDa 之间，这些是其发挥主要作用的亚型。在70 ～85 kDa 处也观察到较小的DISC1 亚型。本研究中发现，DISC1 在AD 患者大脑中的表达较年龄性别相匹配的非AD 患者的表达水平更低，提示DISC1 可能是一个与AD 发病相关的重要因子。

脑内Aβ斑块的形成与异常沉积是导致AD 病理进展的一个关键因素，脑内Aβ斑块的沉积可导致神经元树突棘丧失，神经突触进行性减少，最终导致AD 患者学习记忆能力下降。树突棘（dendrit⁃ic spine）是树突分枝上的棘状突起，是神经元间形成突触的主要部位。在学习记忆过程中，突触可塑性常与树突棘的形成、脱落、扩张和萎缩等形态变化相伴发生。本研究将培养的原代胎鼠神经元进行Aβ处理，体外模拟Aβ对神经元的毒性作用，结果发现过表达DISC1 能够挽救Aβ造成的树突棘的丧失及长时程增强（LTP）的抑制，提示DISC1 在AD 的发病过程中可能通过改善突触的可塑性发挥延缓AD 进展的作用。

目前，大量的基础研究致力于减少Aβ生成而改善AD 患者的学习记忆能力［19-20］。先前的研究中发现，在4月龄的APP/PS1 小鼠海马中（此时海马中尚未有明显的Aβ斑块形成）过表达DISC1，8月龄时检测，其可以有效减少Aβ斑块的沉积，并提高AD 小鼠学习记忆能力。而在本研究中发现，在8月龄的APP/PS1 小鼠海马中（此时海马中已经有明显的Aβ斑块沉积）过表达DISC1，6 个月后检测，其仍可以有效减少Aβ斑块的沉积并提高其学习记忆能力。以上结果提示，过表达DISC1 不仅可以在早期预防脑内Aβ斑块的沉积及改善其学习记忆能力，并且对已经有稳定Aβ斑块沉积的AD 患者仍有减少Aβ斑块沉积及改善其学习记忆能力的作用，其中涉及的更深入机制，需要在将来的研究中进一步探索。虽然本实验在APP/PS1转基因小脑内过表达DISC1，证明DISC1 有效减少了Aβ的生成，但其不能完全模仿生理状态下没有DISC1 作用时Aβ的生成情况，因此，在后续的实验中希望能够构建DISC1 的敲除鼠并将APP/PS1 小鼠与其杂交产生DISC1 敲除的APP/PS1 小鼠，从而进一步在体内研究DISC1 对AD 小鼠Aβ斑块的形成。

综上所述，脑内DISC1 水平下调可能是AD 发病的一个重要危险因子，过表达DISC1 能够通过减少脑内Aβ斑块沉积及减弱Aβ斑块沉积造成的树突棘丧失和LTP 抑制，从而提高AD 小鼠的空间学习记忆能力。本研究挖掘了DISC1 作为AD 治疗靶点的潜能，为AD 的治疗提供了理论基础。