外阴阴道念珠菌病患者白念珠菌分离情况及ERG5基因位点突变分析

金蕾，史伟峰（.无锡市妇幼保健院检验科，江苏无锡4000；.苏州大学附属第三医院检验科，江苏常州3000）

外阴阴道念珠菌病（vulvovaginal candidiasis，VVC）是一种临床常见妇科疾病，感染率仅次于细菌性阴道炎，极大地影响妇女生殖健康［1］。白念珠菌是该病常见的致病菌，感染率约为80%［2］。唑类药物是目前临床治疗VVC的首选药［3］，但随着唑类药物的广泛使用，耐药菌株日益增多。减少以及预防耐药株的出现，已经成为医学领域的研究热点。唑类药物通过抑制14-α去甲基酶，从而抑制麦角甾醇合成，破坏真菌细胞膜，从而发挥抗真菌作用［4］。目前，麦角甾醇合成通路中活性药物靶酶基因Ergosterol（简称ERG）的突变或者高表达，被认为是白念珠菌耐唑类药物的主要机制之一［5］。本研究旨在了解VVC患者白念珠菌的检出情况，并探究唑类药物耐药率及ERG5基因突变情况，为临床抗真菌药物的选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象及菌株 收集无锡市妇幼保健院2018年6—12月妇产科门诊VVC患者阴道分泌物共500例，患者年龄25～49岁。患者临床症状为外阴红肿瘙痒，分泌物增多，并且呈白色豆腐渣样。白念珠菌ATCC 10231购自于郑州安图生物公司。

1.2 主要仪器与试剂 PCR仪（美国ABI公司）；凝胶成像仪（上海复日科技公司）；电泳仪、电泳槽（北京六一仪器厂）；质谱仪（德国布鲁克公司）；真菌快速培养鉴定药敏试剂盒（郑州安图生物公司）；dNTP、10×PCR Buffer（含Mg2+）、Taq Plus DNA聚合酶、Ezup柱式基因组DNA抽取试剂盒、B600090 PCR扩增试剂盒（上海生工生物工程公司）。

1.3 真菌镜检及培养 将采集的阴道分泌物标本均匀涂抹于载玻片上，滴加50μL 10%KOH溶液，盖上盖玻片，加热固定，冷却后在显微镜下观察标本有无菌丝或者孢子。将镜下见菌丝或孢子的样本接种沙保弱琼脂平板，35℃培养24～48 h，若平板上呈现乳白色或者淡黄色、表面光滑湿润呈奶油状菌落，可以初步判断为念珠菌属。

1.4 真菌鉴定及药敏试验 挑取念珠菌属单个菌落，转种于科玛嘉显色培养基，35℃培养24～48 h，进行初步鉴定。对于翠绿色菌落采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）鉴定：滴加70%甲酸溶液1μL至靶板，取少量待测菌均匀涂抹，干燥后滴加1μL基质溶液，采用Microflex质谱仪进行鉴定。依据仪器说明书进行结果判读。采用真菌快速培养鉴定药敏试剂盒进行药敏试验，依据说明书进行操作及药敏结果判读。

1.5 基因扩增及测序 采用Ezup柱式基因组DNA抽取试剂盒从目的菌株中提取DNA，经PCR扩增试剂盒对ERG5基因进行扩增。用Primer Premier 5软件设计引物，引物序列F：5′-ATGAATT CAACAGAGGTCGATAA-3′；R：5′-CTATAAACTCT TTAATGGGTCTCT-3′，由上海生工生物公司合成。PCR扩增反应总体积50μL，包括模板DNA 2μL，上、下游引物（10μmol/L）各2μL，dNTP 2μL，Taq酶1μL，10×PCR Buffer 5μL，ddH2O 36μL。扩增反应参数：95℃5 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃50 s，35个循环；72℃5 min。取PCR产物5μL经10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察，目的条带切胶回收后送至上海生工生物工程公司进行双向测序。PCR测序反应总体积20μL：纯化的PCR产物（10 ng/μL）1μL，2.5×BigDye 4μL，5×BigDye Seq Buffer 2μL，3.2 pmol/μL测序引物1μL，灭菌去离子水12μL。在美国ABI公司3730XL测序仪上按以下条件反应：96℃1 min；96℃10 s，50℃5 s，60℃4 min，25个循环；4℃5 min。所得DNA片段测序长度512 bp。将序列与GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的标准序列比对，通过BLAST软件分析，寻找突变位点。

2 结果

2.1 菌种分布 500例VVC患者阴道分泌物中313例镜下可见菌丝或孢子，其中285例检出念珠菌菌属，经显色培养基鉴定，白念珠菌占比最高，为54.7%（156株），其次为光滑念珠菌22.5%（64株），热带念珠菌16.5%（47株），克柔念珠菌4.2%（12株），其他真菌2.1%（6株）。156株经显色培养鉴定为白念珠菌的菌株经质谱鉴定为白念珠菌（评分＞1.8）155株，余1株评分1.685分。

2.2 药敏结果 155株白念珠菌菌株对5-氟尿嘧啶均敏感，2株菌株对制霉菌素耐药（耐药率1.2%），67株对酮康唑耐药（耐药率43.2%），97株对氟康唑耐药（耐药率62.5%），80株对酮康唑耐药（耐药率51.6%）。

2.3 测序分析 选取3株对多种唑类药物（氟康唑、酮康唑、咪康唑）耐药菌株（编号分别为CA21、CA73、CA81）、3株对唑类药物均敏感菌株（编号分别为CA17、CA33、CA90）以及1株质控菌株ATCC 10231进行ERG5扩增后测序。将测序序列与已知基因序列（NC_032095.1）进行比对和分析，在敏感菌株CA33检出1个同义突变位点G528A（176位氨基酸谷氨酸无变化），在耐药菌株CA81检出1个错义突变位点G528C（176位氨基酸谷氨酸突变为天冬氨酸）。见图1。

图1 CA81菌株碱基突变位点

3 讨论

本研究500例VVC患者阴道分泌物中313例镜下可见菌丝或孢子，其中285例检出念珠菌菌属，其余28例检出酵母菌类菌属，从285例标本中分离出菌种分布以白念珠菌为主（54.7%），其次为光滑念珠菌（22.5%）、热带念珠菌（16.5%）、克柔念珠菌（4.2%）和其他真菌（2.1%）。非白念珠菌比例为45.3%，稍低于国外文献报道的46.8%～68.9%［6］，可能与菌种地域性差异有关［7］。经涂片镜检结合显色培养基可实现常见念珠菌的快速鉴定，本文采用该模式实现285例样本的检测，而对于白念珠菌的显色鉴定亦经过质谱技术进行复核，虽然存在1株质谱鉴定低分值菌株，但仍具有较高的鉴定一致率。

Martel等［8］发现1株耐唑类抗真菌药物白念珠菌菌株同时存在ERG5和ERG11基因双重突变。有研究提出ERG5基因突变可能导致了麦角甾醇合成途径受阻，使白念珠菌菌株对唑类抗真菌药物产生耐药性［9］。本研究结果显示白念珠菌临床敏感株和耐药株的ERG5基因均存在突变，其中编号为CA33的敏感株，发生了1个同义点突变，位点为528 bp，突变前碱基所在的密码子为GAG，编码的氨基酸为谷氨酸（Glu），突变后未引起氨基酸的变化；编号为CA81的耐药株，发生了1个错义点突变，使其第528位碱基由G突变为C，发生了氨基酸置换，导致第176位氨基酸由谷氨酸（Glu）变成了天冬氨酸（Asp）。第528号位点是较容易突变的位点，耐药菌株在该位点发生了错义突变，引起了氨基酸的置换，提示与耐药的产生有关［10］。

但白念珠菌对唑类抗真菌药物的耐药机制比较复杂，有可能是某种关键基因突变或者高表达导致菌株产生耐药性，也可能是多种机制共同作用的结果。本研究进行测序的菌株有限，因此后期将增加测序的菌株，深入研究ERG5基因突变与真菌药物关系，为治疗白念珠菌珠菌感染提供一定的理论依据。