A型和AB型红细胞表面A抗原类型调查*

赵媛，李代红，刘伟，刘纯，艾丽萍（.天津市第一中心医院输血科，天津3009；.天津市秀鹏生物技术开发有限公司，天津30039）

ABO抗原系统是人类最重要的血型系统，与输血安全和器官移植等密切相关。非ABO同型输血可能导致急性溶血反应、迟发性溶血反应、输血无效等严重后果。除了正常的ABO血型外，还存在着由于基因突变引起的ABO亚型，包括A2和A2B的A2亚型是最常见的ABO亚型。为探讨开展分子生物学方法检测A2抗原的必要性，本研究主要调查ABO血型正反定型相符的A和AB型患者红细胞表面A抗原类型。

1 材料与方法

1.1 研究对象 天津市第一中心医院2020年1月至8月ABO血型检测中，正反定型相符A型和AB型的患者3 024例，男1 467例，女1 557例。患者年龄1～97岁，成人2 543例，儿童481例。分子生物学确定A2和A2B血型的输血患者作为观察组，临床诊断为同病种且当日输血的患者作为对照组，排除外科失血＞50 mL或严重感染患者。每输入2 U悬浮红细胞，输血后24 h内血红蛋白（Hb）升高≥10 g/L视为输血有效。

1.2 主要仪器与试剂 2005-1型离心机（珠海贝索公司）；X-15R型离心机（美国贝克曼库尔特公司）；Erytra全自动血型配血仪（西班牙戴安娜公司）；DDY-Ⅲ2型电泳仪（北京六一生物科技公司）；ALPHAImager-EP凝胶成像分析仪（美国阿尔法公司）；AB9700PCR仪、ABI3730基因测序仪（美国Applied Biosystems公司）。

微柱凝胶血型卡（西班牙戴安娜公司）；双花扁豆植物凝集素抗A1（荷兰Sanquin公司）；DNA提取试剂盒（北京天根生化公司）；ABO-SSP试剂盒、ABO基因扩增与测序引物（天津秀鹏生物科技公司）。

1.3 标本采集与处理

1.3.1 血清学检测 用EDTA-K2抗凝血标本进行ABO正反定型、A1抗原检测，按照《AABB技术手册》（第18版）［1］严格操作。

1.3.2 分子生物学检测 抗A1阴性标本严格按照DNA提取试剂盒说明书提取DNA，调整DNA浓度30～50 ng/μL，A260nm/A280nm为1.6～2.0。用人类ABO血型基因分型检测试剂盒进行PCR-SSP基因分型，110μL dNTP-Buffer工作液、0.9μL Taq酶（5 units/μL）、10μL DNA组成混合液，采用10μL作为反应体系。PCR产物进行25 g/L琼脂糖凝胶电泳并用紫外凝胶成像分析仪观察结果。同时委托天津市秀鹏生物技术公司用基因测序仪对ABO基因第1～7外显子测序，扩增引物序列为5′-GCTG CCTCTGGAAGGGTGGT-3′和5′-ACCAAGGGCGGGA GGGG-3′。PCR反应条件：96℃预变性120 s；96℃变性20 s，68℃退火60 s，循环5次；96℃变性20 s，65℃退火45 s，72℃延伸30 s，循环10次；96℃变性20 s，62℃退火45 s，72℃延伸30 s，循环15次；72℃延伸180 s。扩增产物纯化：37℃20 min，80℃20 min，4℃保存。结果由Chro-mas 2.31软件进行序列分析。

1.4 统计学分析 用SPSS 20.0统计学软件进行。Tmin≥5，N≥40时使用卡方检验；1≤Tmin＜5，N≥40时用校正卡方检验；Tmin＜1或N＜40时用Fisher精确检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血型结果 3 024例正反定型相符A和AB型中，血清学检出A2和A2B 48例（1.59%）。618例AB型中血清学检出A2B血型32例（5.18%），2 406例A型中血清学检出A2血型16例（0.67%），差异有统计学意义（χ2=64.1，P＜0.01）。

根据PCR-SSP与基因测序结果，共确认A2和A2B 16例（0.53%），PCR-SSP结果（图1）与基因测序结果（图2）相符。基因型：5例A102/O01，2例A102/O02，2 例 A101/B101，23 例 A102/B101，1 例A201/O01，3例A205/O01，2例A205/O02，2例A201/B101，8例A205/B101。16例A2基因中A205（81.25%）发生频率高于A201（18.75%）。A2B血型检出10例（1.62%），高于A2血型检出6例（0.25%），差异有统计学意义（χ2=15.0，P＜0.01）。A2及A2B表型和基因型发生频率与2013年的一项针对中国人群血型调查［2］对比，差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

图1 部分A2和A2 B血型PCR-SSP电泳结果

图2 A201、A 205基因型部分测序结果

表1 中国人群A2和A2 B发生频率比对结果

2.2 输血情况 16例A2（A2B）患者中有11例接受输血治疗，输注悬浮红细胞共31.5 U，经检测献血员血液A1抗原全部阳性。5例（45.45%）发生输血不良反应，其中2例（A201/B101、A205/O02）发生迟发性血清学反应均为输血后9～13 d血浆中检出抗A1抗体；3例发生输血无效（27.27%）。当日同病种输血患者23例，2例（8.69%）发生输血不良反应，2例发生输血无效（8.69%）。输血不良反应发生情况差异有统计学意义（P＜0.01）；输血有效率低于当日同病种输血患者，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

A2和A2B血型是ABO系统最常见亚型，国内外研究显示正确检测A2和A2B血型有利于提高器官移植安全［3-4］和临床输血安全［5-7］。血清学AB型人群中A2B发生率高于A型人群中A2发生率，已有报道中［8-10］同样存在此种与孟德尔遗传规律不符的不平衡现象。A1和A2血型的A抗原存在数量上的差异，每一个红细胞表面A抗原数量通常是：A1，8×105～12×105；A2，1×105～4×105；A1B，5×105～9×105；A2B，1×105［11］。目前临床上通常依赖于限定外源性植物凝集素抗A1浓度检测红细胞表面A抗原数量来区分A1和A2血型。因此，推测由于AB型红细胞表面A抗原数量低于A型红细胞，使A2B血型更易被血清学方法检出。

本研究PCR-SSP方法与基因测序结果一致，A2基因发生率0.53%与近年报道［6，12-13］相符，显示中国人群A2基因并非罕见。本研究共检出A205基因型13例，A201基因型3例，未检出A2其他基因型；与中国其他地区的研究结果相符［2，14］。本研究显示A2与A2B基因型发生率同样存在不平衡现象，有研究认为这一不平衡是由于人群中A204基因型的存在导致［15］，但本次研究并未涉及该基因型。启动子甲基化、反义RNA、组织特异性转录因子结合蛋白、外显子1上游4 kb的小卫星增强区等因素都可能参与ABO血型基因调控［1］，对基因频率的影响有待进一步研究。

本研究中发生输血不良反应的A2和A2B血型患者迟发性血清学反应占40%，高于该类型在整体人群中的发生频率。普遍认为A201是针对A1抗原产生抗A1抗体的最主要A2基因型，但本次发现的输血病例中A205也会产生抗A1抗体。本研究中输血治疗效果以24 h内Hb为判定标准，输血有效率未发现统计学意义，受判定标准局限和临床干扰因素影响无法对输血24 h后效果继续评价，对迟发型血清学反应对输血治疗效果的影响有待今后继续研究。

通过本研究发现，中国人群中存在一定比例的A2和A2B血型，PCR-SSP方法可以准确鉴定血型基因型，输血前准确鉴定A2和A2B血型有利于提高临床输血安全。