糖尿病肾病患者血清人巨细胞病毒miR-US4-3p水平变化及价值*

王萍萍，王成，王静，张明超，张春妮，张辰宇，汪俊军（.南方医科大学第一临床医学院&东部战区总医院临床检验科，南京000；.东部战区总医院国家肾脏疾病临床医学研究中心全军肾脏病研究所，南京000；.南京大学生命科学学院，南京0046）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病（diabetic mellitus，DM）晚期主要微血管并发症，也是终末期肾病的主要病因［1］，但其发病机制尚不明确。人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是一种具有囊膜包被的线性双链DNA病毒，其基因组大小为220～240 kb，可在新生儿和免疫功能低下的个体中引起较高的发病率和死亡率，是目前发现的唯一可产生miRNA的β疱疹病毒，HCMV能够编码26个成熟miRNA［2］。越来越多的证据显示，HCMV编码的miRNA可调节各种生物过程，包括病毒复制、潜伏感染、免疫逃逸和宿主细胞周期［3-5］。有报道显示，原发性高血压患者血浆中hcmv-miR-UL112表达较健康对照者明显上调，提示HCMV编码miRNA可能是介导HCMV感染导致血管损伤和血压升高的关键因子［6］。在2型糖尿病（T2DM）、胶质母细胞瘤及口腔扁平苔藓患者外周血中也观察到HCMV miRNA的高表达［7-8］，提示循环中HCMV编码miRNA是一类潜在的新型疾病生物标志物。研究证实，HCMV miR-US4-3p靶向内质网氨肽酶ERAP1，ERAP1功能的变化或丧失会改变组织相容性复合体（MHC）Ⅰ分子呈递的抗原组成从而影响NK细胞和CD8+T细胞的激活，导致免疫应答缺陷和疾病的发生［9-10］。DN的发生发展与炎症和免疫反应有关［11］，我们推测miR-US4-3p与DN之间可能存在关联，目前关于miR-US4-3p在DN患者中的表达变化及其临床价值研究未见报道。因此，本研究通过qRT-PCR方法检测DN患者、单纯DM患者和健康对照者中血清miR-US4-3p的表达，以探讨其在DN中的潜在临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2019年4月至2020年1月于中国人民解放军东部战区总医院（原南京军区总医院）确诊的T2DM患者128例，所有患者均符合T2DM诊断标准［12］。其中T2DM患者（DM组）64例，DN患者（DN组）64例。DM组男性48例，女性16例，年龄（55.92±17.46）岁，DM病程［3（0.08，7）］年；DN组男性42例，女性22例，年龄（55.78±11.88）岁，DM病程［10（5，16）］年。DN诊断标准患者符合下列任何一项者：①大量清蛋白尿；②糖尿病视网膜病变伴微量蛋白尿；③肾脏穿刺活检符合DN病理表现，即诊断为DN［13］。选取同期健康体检者64例作为对照组，男性42例，女性22例，平均年龄（53.20±10.74）岁。排除标准为：其他急慢性肾病、继发性糖尿病、心脏与肝脏等全身疾病引发的肾脏疾病、创伤、急性感染、恶性肿瘤和自身免疫病者。各组性别、年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究获中国人民解放军东部战区总医院伦理委员会批准许可（批准文号：2018NZGKJ-096），研究对象均签署了知情同意书。

1.2 主要仪器与试剂 D10糖化血红蛋白检测仪（美国Bio-Rad公司）；7600型全自动生化分析仪（日本Hitachi公司）；Cobas e601型全自动电化学发光免疫分析仪（瑞士Roche公司）；5418型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；SAS67120型超纯水仪（美国Millipore公司）；2720型PCR仪（美国ABI公司）；LightCycler®96实时荧光定量PCR仪（瑞士Roche公司）。

RNA提取试剂即酸性水饱和酚（北京索莱宝公司）；分析纯级氯仿、异丙醇、无水乙醇（上海国药集团试剂公司）；人工合成的peu-MIR2911成熟体（上海Invitrogen公司）；miRNA逆转录引物及Taq-Man探针（美国ABI公司）（peu-miR2911货号：242025_mat；hcmv-miR-US4-3p货号：469699_mat）；逆转录体系和qRT-PCR体系所用试剂（大连TaKa-Ra公司）；总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）试剂及校准品购自英国Randox公司；低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoproteincholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）试剂及校准品购自日本第一化学株式会社；糖化血红蛋白（Hemoglobin A1c，HbA1c）检测试剂盒购自美国Bio-Rad公司；半胱氨酸蛋白酶抑制剂C（Cystatin C，Cys C）检测试剂盒购自宁波普瑞柏生物技术公司；空腹血糖（FPG）检测试剂盒购自富士胶片和光纯耀（上海）化学公司；肌酐（creatinine，Cr）检测试剂盒购自四川maccura生物公司；甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）试剂及校准品购自瑞士Roche公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标本采集与处理 采集研究对象清晨空腹状态下静脉血3～5 mL，离心后获取上层血清液，于-80℃保存，用于miRNA和生化指标的检测。

1.3.2 血清HCMV miRNA表达的检测 基于Taq-Man探针的qRT-PCR方法检测血清miR-US4-3p（5′-UGACAGCCCGCUACACCUCU-3′）的 水 平。首先，取单个血清样本100μL，总RNA提取采用酸性苯酚-氯仿一步法进行抽提［14］，每个血清样品在提取过程中均加入20μL人工合成的浓度为107fmol/L的植物MIR2911（5′-GGCCGGGGGACGGGC UGGGA-3′）成熟体作为外源性参照，用于校正RNA提取效率和误差，提取后的总RNA溶于22μL DEPC水。

血清RNA逆转录PCR反应体系为10μL：DEPC水3.5μL、5×AMV缓冲液2μL、dNTPs 1 μL、逆转录引物1μL、AMV逆转录酶0.5μL、RNA样品2.0μL。反应条件参数为：16℃30 min；42℃30 min；85℃5 min，每个反应均为1个循环。逆转录所得cDNA冻存于-20℃。

qRT-PCR反应体系为20μL：ddH2O 14.77μL、10×PCR缓冲液2μL、25 mmol/L MgCl21.2μL、dNTPs 0.4μL、Taq聚合酶0.3μL、miRNA检测探针0.33μL、cDNA 1μL。反应条件参数为：95℃5 min，1个循环；95℃15 s，60℃1 min，共40个循环。

实验结果采用2-ΔCt方式计算miR-US4-3p的相对表达量，ΔCt=Ct目的miRNA-CtMIR2911。每个Ct值为相应样品重复测定3次后所得均值，同时以不含RNA的模板的ddH2O水作为阴性对照。

1.4 统计学分析 采用SPSS20.0软件对数据进行统计学分析。计量资料采用单样本Kolmogorov-Smirnov检验数据分布的正态性。正态分布资料采用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用两独立样本的t检验；多组间比较采用单因素方差分析，方差齐性时组间两两比较采用LSD-t检验，方差非齐性时采用Tamhane′s T2检验。非正态分布资料采用中位数（第25百分位数，第75百分位数）［M（P25，P75）］表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验，多组间比较采用Kruskal-wallis H秩和检验。计数资料采用百分比表示，两组间比较采用χ2检验。变量间相关性分析采用Spearman相关分析。采用ROC曲线和Logistic回归分析血清miR-US4-3p水平对DN预测和区分价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象的一般资料 对DN、DM和对照组患者的一般资料进行单因素方差分析，结果显示，3组患者的DM病程、HbA1c、FPG、TG、LDL-C、HDL-C、Cr和Cys C差异均有统计学意义（P均＜0.05）。对差异有统计学意义的指标进行两两比较，结果显示DN组和对照组间，HbA1c、FPG、TG、LDL-C、HDL-C和Cre差异均有统计学意义（P均＜0.05）。DN组与DM组相比，糖尿病病程、HbA1c、LDL-C、Cre和Cys C差异均有统计学意义（P均＜0.05）。DM组与对照组相比，HbA1c、FPG、TG、HDL-C差异均有统计学意义（P均＜0.05）。而各组研究对象性别、年龄等比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

表1 3组研究对象临床基本资料比较

2.2 各组血清miR-US4-3p表达水平比较 qRT- PCR结果显示，与对照组及DM组相比，DN组患者血清miR-US4-3p的表达水平升高（P＜0.001），而DM组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组血清miR-US4-3p表达水平比较

2.3 血清miR-US4-3p与DN患者临床指标之间的相关性分析 Spearman相关性分析显示，DN患者血清miR-US4-3p与Cys C（r=0.288，P=0.023）、PTH（r=0.493，P=0.045）呈正相关，与eGFR呈负相关（r=-0.280，P=0.026），而与HbA1c（r=-0.127，P=0.342）、FPG（r=0.028，P=0.826）、TG（r=0.032，P=0.803）、TC（r=0.135，P=0.288）、LDL-C（r=0.062，P=0.629）、HDL-C（r=-0.103，P=0.468）、Cr（r=0.245，P=0.053）、糖尿病病程（r=-0.053，P=0.699）不相关。

2.4 血清miR-US4-3p对DN的预测及区分价值 ROC曲线分析显示，miR-US4-3p能够较好区分DN患者和健康对照者，其ROC曲线下面积（areas under the ROC curve，AUC）为0.792（95%CI：0.715～0.869），见图1A。当cut-off值为0.011时，miR-US4-3p诊断DN的敏感性为71.9%，特异性为73.4%。此外，miR-US4-3p在鉴别DM和DN的AUC为0.748（95%CI：0.664～0.832），见图1B。在cut-off值为0.012时，其敏感性为71.9%，特异性为64.1%。

图1 miR-US4-3p对DN预测和区分的ROC曲线

Logistic回归单因素模型中仅纳入血清miRUS4-3p分析，结果显示：以对照组为参考类别，高血清miR-US4-3p水平与DN的发生相关（OR=7.065，95%CI=3.247～15.376，P＜0.001）；以DM组为参考类别，血清miR-US4-3p水平的升高还可区分DN和DM（OR=4.879，95%CI=2.304～10.332，P＜0.001）。多因素模型中除了纳入血清miR-US4-3p外，还同时纳入年龄、性别及血脂指标（TG、TC、LDL-C、HDL-C），结果显示，在校正年龄、性别及其他血脂水平影响后，血清miR-US4-3p水平的升高仍与DN的发生密切相关（OR=7.236，95%CI=2.633～19.889，P＜0.001），对DN和DM的区分仍具有统计学意义（OR=6.466，95%CI=2.778～15.052，P＜0.001）。见表3。

表3 多因素Logistic回归分析血清miR-US4-3p水平对DN的预测及区分价值

3 讨论

DN约占DM患者的40%，但其发病机制尚未明确。既往研究已证实，多种miRNAs参与肾小管上皮细胞氧化应激反应、糖代谢紊乱、肾纤维化、系膜细胞肥大的病理过程［15］。病原微生物与人类疾病的关系日益受到重视，诸多证据表明HCMV感染与炎症反应激活、血管重塑相关，HCMV利用自身编码的miRNAs调节自身及宿主细胞的基因差异表达可进一步完成免疫逃避、细胞进程调节、病毒DNA复制以及对细胞凋亡的调节功能。HCMV miRNAs的研究可为进一步了解病毒致病机制和宿主防御机制提供线索。Pan等［16］研究表明，血清HCMV miR-US4-1可作为预测干扰素α治疗慢性乙型肝炎患者疗效新的生物标志物，提示检测HCMV miRNA的变化在疾病中具有重要意义。然而，HCMV miRNA与DN之间的联系尚未得到阐明。本研究发现，DN患者血清HCMV miR-US4-3p的表达显著高于健康人群和DM患者，而DM患者与健康人群间的表达差异无统计学意义，进一步多因素Logistic回归分析显示，在校正了年龄、性别、其他血脂指标影响后，血清高miR-US4-3p是DN发生的危险指标，且对DN和DM患者的鉴别具有意义，提示血清miR-US4-3p有望成为DN发病的辅助诊断指标及DN与DM间潜在的鉴别指标。

研究显示，免疫及炎症反应在DN发病机制中发 挥 重 要 作 用［11］。Kim 等［9］报 道，HCMV miR-US4-1可调控ERAP1 mRNA的翻译水平，从而极大地降低抗原的呈递，逃逸宿主对其的监控和免疫。Huang等［5］研究表明，hcmv-miR-UL112通过下调Ⅰ型IFN信号传导抑制NK细胞的细胞毒性来破坏先天免疫，表明HCMV可以利用基于miRNA的免疫逃逸机制。既往研究证实，HCMV感染导致细胞转录因子NF-κB的激活［17］，而高血糖导致糖基化终产物增多，可通过NF-κB信号通路诱导巨噬细胞迁移并释放炎症细胞因子TNF-α及IL-1β，NF-κB活化可刺激趋化因子和黏附分子的转录。近年来研究证实内皮功能障碍对肾小球疾病的发生、发展有着重要影响，肾小球内皮细胞通过与系膜细胞及足细胞的交流可进一步促进DN发展。Shen等［18］研究发现，HCMV miR-UL112可通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路、细胞黏附分子、趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用等途径诱导血管细胞（如内皮细胞、平滑肌细胞）功能障碍，导致血管损伤；miR-UL112还可通过调控ACE2基因在肾脏中的表达，影响肾素血管紧张素系统从而调控机体血压水平［19］。因此，我们推测miR-US4-3p可能参与调节DN的免疫逃避及炎症反应进程，并通过诱导血管内皮功能障碍，使足细胞、系膜细胞发生改变，进一步加重DN发展。本研究中相关分析证实血清miR-US4-3p的表达与Cys C、PTH显著正相关，Cys C不受性别、年龄等因素影响，并且肾脏是其唯一清除器官，能够灵敏反映肾脏损伤程度［20］；DN时由于患者肾小球通透性增强，血钙丢失刺激PTH分泌增多，因此PTH的检测也可作为判定早期肾脏损伤的预警指标之一。以上研究均提示miR-US4-3p参与DN发展进程。

研究发现，细胞外囊泡（EVs）中富含miRNA，并能保护其不被降解［21］。越来越多的证据表明，EVs通过细胞与细胞之间的交流在病毒感染中起着重要作用。已经发现病毒感染可以改变宿主细胞中EVs miRNA的表达，Zhang等［2］通过深度测序分析人类胚胎肺成纤维细胞（HELF）中EVs miRNA发现，EVs中miR-US25-1-5p和miR-UL112-3p在感染后6 h水平升高，HCMV感染婴儿血清EVs miR-US25-1-5p和miR-UL112-3p的水平与肝损害密切相关。从Zhang等［2］结果中发现，感染细胞可释放更多的EVs，HCMV miRNA可以通过EVs转运至受体细胞发挥作用。Ding等［22］发现，在HCMV潜伏期，口腔扁平苔藓病患者血浆样本中hcmv-miR-UL59大多数以外泌体形式存在。因此，可以推测HCMV miRNA的变化也可能是由病毒感染或炎症细胞分泌的EVs引起。但是，各种疾病中HCMV miRNA的存在形式仍需进一步验证，HCMV感染与EVs miRNA之间的具体机制仍然未知。

综上所述，血清HCMV miR-US4-3p在DN中高表达，其可能是DM患者肾脏损伤的重要生物学标志物，但血清miR-US4-3p与微量尿蛋白指标的比较以及其在DN发生发展过程中的具体病理生理机制仍需深入研究。鉴于本研究例数有限，仍需要进一步扩大样本量、开展前瞻性研究及临床随访再次验证和确定血清HCMV miR-US4-3p对DN患者的临床价值。