西藏琵蝎肠道细菌多样性研究

向礼波,何 敏,郑 恒*

(1.湖北省农业科学院植保土肥研究所,中国湖北武汉430000;2.西藏大学理学院,中国西藏拉萨850000)

蝎子是地球上最古老的节肢动物之一,在中国,蝎子通常指东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch),属节肢动物门、蛛形纲、蝎目、钳蝎科、正钳蝎属。研究表明东亚钳蝎肠道微生物种类丰富,群落复杂,对东亚钳蝎消化和抵御外来菌群入侵具有重要作用[1]。

与东亚钳蝎不同,西藏琵蝎(Scorpiops tibetanus)属蝎目、真蝎科、西藏琵蝎属,分布在中国西藏,是中国特有种,且生活在生态环境恶劣的青藏高原,因而对其展开研究具有重要科学价值。目前关于西藏琵蝎的研究较少,其肠道微生物的研究尚未见报道。本研究采用Illumina技术对西藏琵蝎肠道细菌进行高通量测序,利用生物信息学等方法对其肠道细菌多样性、群落结构及16S rRNA功能进行研究,目的在于了解西藏琵蝎肠道细菌群落组成、多样性及16S rRNA功能,并探讨其肠道特有细菌的功能,以期为西藏琵蝎肠道细菌的功能探索和进一步开发利用及其适应青藏高原特殊生态环境的机制研究等提供参考。

1 材料与方法

1.1 西藏琵蝎采集及肠道提取

实验采用的西藏琵蝎来源于西藏自治区拉萨市夺底乡,生境如图1所示,按照文献[2]鉴定为西藏琵蝎(Scorpiops tibetanus),形态如图2所示。

图1 西藏琵蝎生境图Fig.1 S.tibetanus habitat

图2 西藏琵蝎形态图Fig.2 S.tibetanus morphology

参照文献[1]的方法,取3只成年西藏琵蝎置于超净工作台,先敲击头部致其死亡,随后75%乙醇浸泡5 min,无菌水冲洗3次,再用解剖刀进行解剖,用镊子取出肠道组织,放入-80℃冰箱保存,以备后续实验使用。

1.2 西藏琵蝎肠道总DNA提取、PCR扩增及测序

采用QIAamp DNA试剂盒(QIAGEN公司,德国)提取西藏琵蝎肠道总DNA,随后取适量样品进行基因组DNA检测,浓度和纯度检测采用NanoDrop ND-2000分光光度计,完整性检测采用1%琼脂糖凝胶电泳(5 V/cm,20 min),浓度符合要求后进行PCR实验。本研究主要对西藏琵蝎肠道细菌16S rRNA中V3～V4可变区进行PCR扩增,通用引物338F ACTCCTACGGGAGGCAGCAG和806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT由上海美吉生物医药科技有限公司合成。反应体系(20 μL):5× buffer 4 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,正向引物(5 μmol/L)0.8 μL,反向引物(5 μmol/L)0.8 μL,聚合酶 0.4 μL,BSA 0.2 μL,模板 DNA 10 ng,加ddH2O至20 μL。PCR扩增条件:95℃3 min;95℃30 s,56℃30 s,72℃45 s,27个循环;72℃10 min,10℃停止实验。扩增成功后,样本送至上海美吉生物医药科技有限公司,在Illumina HiSeq 2500平台上进行高通量测序。

1.3 西藏琵蝎肠道细菌多样性分析

为保证分析质量,用Flash 1.2.11软件对原始序列进行拼接,采用Qiime 1.9.1软件进行序列去重过滤,得到高质量序列。基于97%相似度,利用Uparse 7.0.1090软件在Silva数据库(https://www.arb-silva.de/)进行操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)物种分类学分析和聚类分析,分别在门(phylum)、目(order)、属(genus)3 个分类学水平上分析物种组成[3]。

1.4 西藏琵蝎肠道细菌16S rRNA功能预测

基于eggNOG(evolutionary genealogy of genes:Non-supervised Orthologous Groups,http://eggnog.embl.de/)数据库,使用PICRUSt 1.1.0软件(http://picrust.github.io/picrust/)对西藏琵蝎肠道细菌COG(cluster of orthologous group)功能基因家族、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代谢通路及MetaCyc通路进行注释[4～5]。

2 结果

2.1 西藏琵蝎肠道总DNA提取及高通量测序结果

西藏琵蝎肠道总DNA 3个样本的质量浓度分别为 2.3 ng/μL、1.6 ng/μL 和 2.3 ng/μL,OD260/280分别为1.96、1.95和1.88,OD260/230均为0.01,均符合PCR实验要求。通过高通量测序共得到121 890条原始序列,质控后得到106 686条高质量序列,平均每个样本35 562条。在97%相似水平下注释得到的OTU数量为883,共得到32个门,72个纲,173个目,281个科,479个属。香农(Shannon)稀释曲线均趋于平缓,说明该研究的测序数据合理,大多数的细菌包含在文库中,基本能反映西藏琵蝎肠道样本中细菌的组成,可以在门、目、属上进行多样性分析。

2.2 西藏琵蝎肠道菌群门水平上的多样性

对样品检测到的所有OTU序列进行聚类注释后得到32个门,其中相对丰度≥0.1%的门有12个,优势门为厚壁菌门(Firmicutes,57.82%)和变形杆菌门(Proteobacteria,28.25%),其后依次为放线菌门(Actinobacteria,4.60%)、拟杆菌门(Bacteroidetes,4.36%)、绿弯菌门(Chloroflexi,2.26%)等,具体见图3。

图3 西藏琵蝎肠道细菌门水平的群落结构Fig.3 Community structure of S.tibetanus intestinal bacteria at the phylum level

2.3 西藏琵蝎肠道菌群目水平上的多样性

对样品检测到的所有OTU序列进行聚类注释后得到173个目,其中相对丰度≥0.1%的目有49个,优势目主要为芽孢杆菌目(Bacillales,55.19%),其次为肠杆菌目(Enterobacteriales,8.70%),具体见图4。

图4 西藏琵蝎肠道细菌目水平的群落结构Fig.4 Community structure of S.tibetanus intestinal bacteria at the order level

2.4 西藏琵蝎肠道菌群属水平上的多样性

对样品检测到的所有OTU序列进行聚类注释后得到479个属,其中相对丰度≥0.1%的属有66个。短芽孢杆菌属(Brevibacillus,24.63%)和解硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus,22.91%)为优势属,属于厚壁菌门,其后依次为类芽胞杆菌属(Paenibacillus,7.13%)、肠杆菌科未知属(unclassified Enterobacteriaceae,4.77%)、伯克霍尔德氏菌属(Paraburkholderia,3.83%)、土杆菌属(Geobacter,3.80%)、拉乌尔菌属(Raoultella,3.67%)、青枯菌属(Ralstonia,2.01%)、气单胞菌属(Aeromonas,1.45%)和盐单胞菌属(Halomonas,1.08%)等,具体见图5。

图5 西藏琵蝎肠道细菌属水平的群落结构Fig.5 Community structure of S.tibetanus intestinal bacteria at the genus level

2.5 西藏琵蝎肠道细菌16S rRNA功能预测结果

从eggNOG数据库获得对应的COG家族基因信息,共比对到24个类别(图6),主要的COG功能包括:氨基酸转运和代谢(amino acid transport and metabolism),占9.02%;转录(transcription),占7.02%;无机离子转运和代谢(inorganic ion transport and metabolism),占6.34%;碳水化合物的运输和新陈代谢(carbohydrate transport and metabolism),占6.27%;细胞壁/膜/包膜生物发生(cell wall/membrane/envelope biogenesis),占6.17%;信号转导机制(signal transduction mechanisms),占6.16%;复制、重组和修复(replication,recombination and repair),占5.80%;翻译、核糖体结构和生物发生(translation,ribosomal structure and biogenesis),占5.38%;辅酶转运和代谢(coenzyme transport and metabolism),占4.06%;蛋白质周转、翻译后修饰和分子伴侣(protein turnover,posttranslational modification,chaperones),占3.79%;脂质运输和代谢(lipid transport and metabolism),占3.75%,共计11类功能基因家族,占比 63.76%。此外,未知功能(function unknown)和一般功能基因(general function prediction only)的比例分别为9.60%和8.26%。以上信息提示,未知功能基因丰度占比最大,说明西藏琵蝎肠道细菌具有十分丰富的潜在功能基因。

图6 西藏琵蝎肠道细菌COG功能基因家族预测分析横坐标代表COG二级功能编号,纵坐标代表功能丰度。Fig.6 Prediction and analysis of COG functional gene family of enterobacteria in S.TibetanusAbscissa represents COG secondary function number,and ordinate represents function abundance.

在KEGG数据库注释到300条代谢通路信息,其中在pathway level 1注释到6大类代谢活动,分别为:新陈代谢(metabolism),占47.94%;环境信息处理(environmental information processing),占15.89%;遗传信息处理(genetic information processing),占15.84%;细胞过程(cellular processes),占4.26%;人类疾病(human diseases),占0.85%;生物体系统(organismal systems),占0.72%。未分类(unclassified)和未注释(none)的占比分别为 14.32%、0.17%。此外,MetaCyc通路共注释到414条通路信息,前3类通路依次为PWY-3781有氧呼吸aerobic respiration I(cytochrome c)、PWY0-1586 肽聚糖合成peptidoglycan maturation(meso-diaminopimelate containing)和PWY-7111丙酮酸发酵产异丁醇pyruvate fermentation to isobutanol(engineered)。

3 讨论

本文首次采用高通量测序技术及生物信息学等方法对西藏琵蝎肠道细菌多样性进行研究,结果表明西藏琵蝎肠道细菌十分丰富,群落结构复杂,这可能与西藏琵蝎适应性强、食性杂有关。文中的数据分析结果显示,在西藏琵蝎肠道细菌中厚壁菌门和变形杆菌门为优势类群,与已有报道中其他动物肠道菌优势类群[6～9]一致;优势目为芽孢杆菌目(占比55.19%),与Wang等[10]对虾肠道菌的研究一致;优势属为短芽孢杆菌属(占比24.63%)和解硫胺素芽孢杆菌属(占比22.91%),这是该两个属首次被报道为肠道优势属的研究。王保军等[1]研究表明,东亚钳蝎肠道细菌的优势属为假单胞菌属(Pseudomonas)和不动杆菌属(Acinetobacter),与本文中西藏琵蝎肠道细菌的优势属存在较大差异,这可能和蝎的种类、食性及生境有关;此外,肠杆菌科未知属、气单胞菌属及青枯菌属为两者共有属,其中肠杆菌属为肠道正常菌群,而气单胞菌属及青枯菌属的作用尚不清楚,有待进一步研究。

由于高通量测序片段较短,为16S rRNA的V3～V4可变区,因此本文只对优势种进行了注释和统计。结果显示,优势种为波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillus borstelensis)和解硫胺素芽孢杆菌(A-neurinibacillus aneurinilyticus),以上两株细菌均为首次在动物肠道中发现。已有研究报道,波茨坦短芽孢杆菌可降解甲酚、苯酚及纤维素[11～12];解硫胺素芽孢杆菌可产生生物表面活性剂[13],可降解聚乳酸[14],对铅、锌具有较高的耐受性[15],由此推测它们可能是西藏琵蝎肠道中的特有优势种,具体功能值得进一步研究。

了解动物肠道细菌的功能对动物生理生态的研究以及肠道细菌资源的开发利用具有重要意义,本研究对西藏琵蝎肠道细菌16S rRNA功能的预测结果显示,西藏琵蝎肠道细菌功能基因丰富,包含丰富的初级代谢和次级代谢通路,这为今后西藏琵蝎肠道细菌在宿主代谢、免疫以及维持自身动态平衡等方面的研究提供了参考依据。COG功能基因家族预测分析和KEGG代谢通路分析表明,西藏琵蝎肠道细菌的相关功能以新陈代谢为主,同时环境信息处理和遗传信息处理的功能基因占比较大,这为西藏琵蝎肠道细菌发挥自身功能提供了可能。此外,在MetaCyc通路中有氧呼吸排第一,表明西藏琵蝎肠道细菌中好氧菌和兼性厌氧菌占比较大;丙酮酸发酵产异丁醇排第三,这个通路尚未在动物肠道中发现,其作用和机理有待进一步研究。

该研究对西藏琵蝎3个样本进行合并分析,与单个样本相比,优势门、目、属及种仍是基本一致的,因此该研究满足一般统计方法的最低样本数量要求。为了能更好地反映西藏琵蝎肠道细菌多样性,接下来将结合多样性数据对西藏琵蝎肠道细菌进行可培养研究,并进行抗菌、降解生物质等活性的研究。总之,该研究为西藏琵蝎肠道菌相关研究提供了一定的参考,也为西藏琵蝎及青藏高原其他节肢动物的研究提供了新思路。