油茶半微量种仁中油脂和茶皂素含量的同步提取测定

彭邵锋，吴 红，陆 佳，马 力，陈永忠，邬荣领，王甘春

（1.北京林业大学，北京 100083；2.湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004；3.国家油茶工程技术研究中心，湖南 长沙 410004；4.木本油料资源利用省部共建国家重点实验室，湖南 长沙 410004；5.中南林业科技大学，湖南 长沙 410004）

油茶Camellia oleiferaAbel.属于山茶科山茶属植物，是我国南方特有的经济林树种，与油橄榄、油棕、椰子并称为世界四大木本油料树种。油茶主要分布于我国长江流域及以南的14个省（区、市）的642个县（市、区），其中以湖南、江西、广西分布面积最大。近年来，随着我国经济快速增长和人民生活水平的不断提高，食用植物油消费总量持续增长，需求缺口不断扩大，对外依存度高达70%以上，在一定程度上影响我国粮油战略安全。发展油茶产业，一方面有利于充分利用我国丰富的山地资源，缓解耕地压力，全面落实“藏粮于地、藏粮于技”战略，维护国家粮油安全；另一方面，对有效增加优质食用油供给[1-2]、提高国民健康素质、增加农民收入、助力乡村振兴、改善生态环境、建设美丽中国等方面具有十分重要的意义。油茶产业也因此得到了党和国家的高度重视，国家相关部委和地方各级政府先后出台了一系列政策文件和扶持措施，油茶产业进入发展快车道，油茶种植面积、产量和产值得到迅速增加和提高。

油茶的主要产品——茶油是高级保健食用油，其脂肪酸组成合理，以不饱和脂肪酸为主[3-4]，油酸、亚油酸、亚麻酸等含量较高。除脂肪酸外，茶油中还含有甾醇[5]、维生素E[6]和角鲨烯[7]等多种功能成分。茶油因营养丰富、风味独特、易于吸收、便于储藏而受到广大消费者的青睐和喜爱。油脂和茶皂素是油茶种子中最重要的两种经济成分。随着油茶科学研究特别是新一代良种选育和精深加工技术的纵深推进[8-9]，具有高含油、高脂肪酸成分等优异性状的品种选育以及茶皂素等有效成分的高效提取与利用成为当前油茶研究的新方向。但如何精准测定油茶单颗或者更少量种仁中油脂和茶皂素的含量，成为当前油茶科研工作者急需解决的现实问题。

油茶种子油脂含量测定的常用方法是索式抽提法[10]，该方法所需样品量较大（约2 g），同时需要消耗大量正己烷或石油醚等有毒有害溶剂，耗费时间长（约6 h），提取效率低。对于油茶种子的茶皂素含量测定，一方面有效分离难度较大，另一方面会受到种子油脂的干扰，因此目前茶皂素提取采用的原料多为去除油脂后的饼粕，通过含水乙醇索式抽提后，再采用紫外可见分光光度法测定皂素含量[11]，而油茶种子的茶皂素含量则是通过反推的方式计算而来，难免产生过程误差。可见，针对单颗油茶种子，甚至更少量样品中油脂和茶皂素的提取和测定，传统测定方法已明显不适应，且暂无相关报道。

为了建立油茶半微量种仁的油脂和茶皂素含量同步测定方法，本研究采用商业化的脂肪提取试剂盒提取油茶半微量种仁中的油脂和茶皂素，通过与传统的少量样品油脂提取方法进行比较研究，同时充分参考和吸收常量样品油脂含量测定的Folch法、Bligh法等方法的优点，从而建立起快速、稳定的油脂和茶皂素含量同步测定方法，为油茶品质研究和良种选育提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料采自于湖南省长沙县路口镇明月村湖南省林业科学院油茶基地的油茶树。油茶树栽植于2010年，株行距3 m×3 m，抚育管理条件较好。2017年10月23日，在预先标定好的油茶无性系的5棵样株的树冠中上部，每棵样株随机采集果实3个，混合装入密封袋，迅速带回实验室，及时将果实果皮剥开，取出种子，再剥离种皮，置于-80℃冰箱中保存。试验时，根据需要随机选择若干种仁，经冷冻干燥后，再采用混合型研磨仪粉碎，备用。

浓硫酸、无水硫酸钠、香草醛、80%乙醇、BF3甲醇溶液等均为分析纯，上海国药有限责任公司；去离子水，自制；正己烷（色谱纯），Sigma；茶皂素为标准品；37种脂肪酸（＞99%）、十七烷酸（＞99%）、十七烷酸甲酯（＞99%）均为标准品，Sigma；脂肪提取试剂盒，Sigma。

1.2 仪器与设备

气相色谱-质谱联用仪（SCION），布鲁克；分析天平（ME104E），梅特勒托利多；混合型研磨仪（MM 400），德国莱驰；紫外可见分光光度计（SPECORD 210 PLUS），德国耶拿；脂肪测定仪（SZC-D），上海楚柏。

1.3 方 法

1.3.1 油脂提取率和茶皂素提取率的测定

准确取0.200 0 g样品（100目）和3.9 mL提取液，一并加入10 mL的离心管中，同时加入0.1 mL浓度为10 mg/mL的十七烷酸三甘酯，超声提取，10 000 r/min离心5 min，取上层清液2 mL定容到50 mL，采用紫外吸收光度法测定其中茶皂素的含量。取下层清液于锥形瓶中，旋蒸去除溶剂，油脂称质量，获得油脂质量。在锥形瓶中加入1 mL质量浓度为10 g/L的氢氧化钠甲醇溶液，摇匀，冷凝条件下100℃皂化10 min，加入2 mL 14%的BF3甲醇溶液，60℃下甲酯化5 min，加入正己烷4 mL，饱和氯化钠溶液至瓶颈，边加边震荡，分层后取上层溶液0.2 mL稀释到2 mL进行气相色谱分析，测定油脂中各脂肪酸的含量。

1.3.2 油茶种仁中油脂、茶皂素的传统测定方法

油脂含量的测定依照《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》（GB 5009.6—2016）执行。Folch法参考文献进行试验[12]。茶皂素含量采用脱油后的饼粕，采用70%乙醇在索式抽提器中提取4 h后，采用紫外分光光度法测定[13-14]。

1.3.3 单因素实验

以提取温度、提取时间和料液比为因素，研究温度20～40℃、提取时间3～20 min、料液比1∶10～1∶30 g/mL条件下油脂和茶皂素的提取率。

1.3.4 优化实验

在单因素条件的基础上，采用design expert 8.0软件设计三因素三水平的Box-Behnken中心组合实验，其中提取温度（X1）、提取时间（X2）和料液比（X3）为自变量，油脂的提取率（Y1）和茶皂素的提取率（Y2）为响应值，各因素和水平如表1所示。

表1 Box-Benhnken 试验因素及水平Table 1 Box-Benhnken test factors and their levels

1.3.5 方法学考察

1.3.5.1 稳定性试验

将购自Sigma公司的37种脂肪酸甲酯的混标标准品分别调配成质量浓度为0.05、0.10、0.20、0.50和1.00 mg/L的5个梯度，加入质量浓度为0.02 mg/L的十七烷酸。设定如下色谱条件：毛细管柱（100 m×0.25 mm×0.25 μm）HP-88，进样量1 μL，分流比1:20，进样器温度为250℃，He流速为1 mL/min，升温程序50℃保持1 min，10 ℃/min升到170℃，再以3 ℃/min的升温速度升到230℃，保温23 min。对脂肪酸甲酯混标进行采集，以单个脂肪酸甲酯的浓度为横坐标（X），以各种脂肪酸甲酯与十七烷酸甲酯的峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归。

1.3.5.2 重复性

取油茶种仁6份，每份精确称取0.1 g，分别以2 mL脂肪提取液对其进行提取，同时加入用脂肪提取试剂配制的质量浓度为10 g/L的十七烷酸0.2 mL内标震荡提取3次，合并滤液在60℃下皂化10 min，100℃下甲酯化3 min，趁热用N2吹干，正己烷定容至5 mL。各取1μL注入气相色谱仪进行测定，记录脂肪酸与C17:0甲酯的峰面积的比值。

1.3.5.3 加标回收率

取油茶种仁6份，每份精确称取0.1 g，分别以2 mL脂肪提取液对其进行提取，同时加入质量浓度为10 g/L的十七烷酸0.2 mL内标震荡提取3次，分别加入1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、5 000 μg的十七烷酸三甘酯，合并滤液在60℃下皂化10 min，100℃下甲酯化3 min，趁热用N2吹干，正己烷定容至5 mL。各取1 μL注入气相色谱仪进行分析，记录C17∶0的峰面积。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

在料液比1∶20 g/mL、提取时间10 min的条件下，考察了不同提取温度对油茶种仁中的油脂和茶皂素提取率的影响。由图1可以看出，油脂和茶皂素的溶出规律基本一致，这为油茶种仁油脂和茶皂素含量的同步测定提供了可能。从总体看，随着提取温度的不断升高，油脂和茶皂素的提取率均呈先升后降的趋势，温度对茶皂素的提取率影响更为显著；相同温度时，茶皂素的提取率稍低于油脂。在误差方面，茶皂素提取率误差较油脂提取率误差大，但都低于2%，而当温度在35℃以下时，油脂提取率的误差值低于1%。可见，该方法提取油脂和茶皂素均具有较好的稳定性。由于温度高于30℃时，油脂和茶皂素的提取率都略有降低，且误差增大，因此，在后续的因素实验中选择30℃作为提取温度。

图1 提取温度对油茶油脂和茶皂素提取率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on oil and tea saponin yield

在料液比1∶20 g/mL、提取温度35 ℃的条件下，考察了不同提取时间对油茶种仁中的油脂和茶皂素提取率的影响。由图2可以看出，随着提取时间的增加，油脂和茶皂素的提取率均呈现出先迅速增加后缓慢下降的规律，且两者变化趋势基本一致。自开始至3 min内，油脂和茶皂素的溶出速度很快，3 min时油脂和茶皂素的提取率均大于90%；在9 min时，溶出基本完全；往后随着提取时间的增加，油脂和茶皂素的提取率反而缓慢降低；20 min时，油脂和茶皂素的提取率降低超过1%，且实验误差也明显增大。因此，在后续的因素实验中选择9 min作为提取时间。

图2 提取时间对油茶油脂和茶皂素提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on oil and tea saponin yield

在温度35 ℃、提取时间9 min的条件下，考察了不同液料比对油茶种仁中的油脂和茶皂素提取率的影响，结果见图3。由于本实验中针对的是单颗油茶种仁，质量固定且很小，不同的料液比则需通过调整提取液的体积来实现，也就是说在选定提取溶剂的基础上，通过提高液料比的方式来研究不同料液比对油脂和茶皂素提取率的影响。从图3可以看出，随着液料比的增加，油脂和茶皂素的提取率均呈先上升后下降的规律，当液料比小于20∶1 mL/g时，油脂的提取率均比茶皂素的提取率高；当液料比从20∶1 mL/g增加至25∶1 mL/g时，油脂的提取率明显降低，茶皂素的提取率稍有升高。因此，选料液比20∶1 mL/g为后续优化实验的中心点。

图3 料液比对油脂和茶皂素提取率的影响Fig.3 Effect of material liquid ratio on oil and tea saponin yield

2.2 优化实验

通过三因素三水平响应面设计对各提取条件进行优化。以油脂提取率（Y1）和茶皂素提取率（Y2）为响应值，对多元二次回归方程进行分析，结果见表2。用Design expert 8.0对模型进行分析，结果见表3～4。对实验数据进行多元二次回归分析，得到回归方程为：

式中：Y1和Y2为响应值，分别为油脂和茶皂素的提取率（%）；X1、X2和X3分别为提取时间、提取温度和提取液料比3个因素。油脂模型的R2为0.994 2，失拟误差为0.084，不显著；茶皂素模型的R2为0.998 2，失拟误差为8.325E-003，不显著。表明该模型能很好地拟合油脂和茶皂素的提取条件。

表2 Box-Benhnken实验结果Table 2 Box-Behnken experimental results

通过模型计算，得到最佳的油脂和茶皂素的综合提取条件为：温度31.35℃，时间10.41 min，料液比1∶21.9 g/mL。得到的油脂和茶皂素的提取率分别为99.11%和97.73%。

为了验证模型预测值与实验结果的一致性，对油脂提取率和茶皂素提取率在最佳预测条件下进行了实验验证。验证过程中，设定条件为：温度31.35℃，时间10.41 min，料液比1∶21.9 g/mL，重复实验3次，油脂提取率为（99.22±1.62）%，茶皂素提取率为（97.86±2.03）%，与预测值基本一致，表明该模型能很好地预测半微量油茶仁中油脂和茶皂素的提取率。

2.3 方法验证

2.3.1 线 性

在最优条件下，对方法进行线性验证。棕榈酸：y=0.990 0x+0.001 5，R2=0.999 7。硬脂酸：y=1.010 0x+0.001 6，R2=0.999 8。油酸：y=0.970 0x+0.003 3，R2=0.999 7。亚油酸：y=1.040 0x+0.002 1，R2=0.999 6。α-亚麻酸：y=3.420 0x+0.001 5，R2=0.999 7。二十碳烯酸：y=6.920 0x+0.000 3，R2=0.999 7。可见，所有回归线的相关系数R均大于0.99，证明线性良好。

2.3.2 范 围

为了探究本方法对低质量样品的油脂和茶皂素提取率测定的准确性，测定了从500 mg到10 mg样品的油脂含量和茶皂素含量，含油率为（54.48±0.62）%，茶皂素含量为（9.52±0.42）%，由表5可以看出，样品量为50 mg时，油脂和茶皂素的含量与真值的偏差均在方法测定的标准偏差范围内，表明在此条件下能准确测定其含量，因此，能准确测定的样品最低质量不小于50 mg。

表3 油脂的回归方差分析†Table 3 Regression variance analysis of Camellia oil

表4 茶皂素的回归方差分析Table 4 Regression variance analysis of tea saponin

表5 样品添加量的影响Table 5 Effect of sample addition

同时，为了探究最低质量对不同样品的有效性，选定了10例质量约50 mg的不同油脂和茶皂素含量的样品进行测定，测定次数为6次，表中为6次测定的平均值。由表6可以看出，传统经典方法测定的种仁油脂提取率为26.37%～65.26%，茶皂素提取率为7.69%～11.51%；采用本文建立的方法测定种仁中的油脂和茶皂素的提取率，种仁油脂提取率为25.84%～64.51%，茶皂素提取率为7.91%～11.42%。通过研究本方法与传统经典方法测定值的关系，两种方法的油脂提取率拟合曲线为y=0.976 8x，R2=0.998 9，两种方法茶皂素提取率拟合曲线为y=1.000 6x，R2=0.974 5。可以看出，本方法油脂和茶皂素的测定值与传统经典方法的测定值具有很好的一致性，且对不同样品具有较高的有效性。

表6 样品含量差异的影响Table 6 Effect of sample varieties

2.3.3 精密度

油脂6次测定的平均标准偏差为1.34%，茶皂素6次测定的平均标准偏差为1.74%，均小于2.0%，表明该方法精密度高。

2.3.4 准确度

平均加标回收率（n=6）分别为：棕榈酸100.07%、硬脂酸98.64%、油酸99.39%、亚油酸100.92%、α-亚麻酸97.13%、二十碳烯酸95.64%、茶皂素98.51%，可见各回收率均在98%～102%之间，表明该方法准确度好。

2.4 油脂脂肪酸组成的测定

选择了10例来自不同父本和母本的种仁样品测定脂肪酸组成，结果见表7。由表7可以看出，茶油中主要成分为油酸，与已发表的文献一致[15-17]，10例样品中油酸的含量为79.181%～88.432%，其次为棕榈酸和硬脂酸，这也与相关文献报道的含量范围基本接近[18-20]。本方法从测定的样品中都检测出α-亚麻酸，与文献中报道的不是所有样品都含有α-亚麻酸略有不同，说明参试的这些油茶良种具有别的品种所不具备的脂肪酸成分，为定向育种提供了品种资源和科学依据，同时也说明了本方法也能有效提取种仁中的多不饱和脂肪酸。因此，本方法适用于油茶种仁油脂和茶皂素的同步测定，特别是质量为半微量范围内的种仁，可为油茶优良品种培育过程中需要研究单颗种子的油脂和茶皂素含量提供可靠的测定方法。

表7 样品脂肪酸的组成Table 7 Fatty acid composition of the test sample

2.5 几种方法的对比

比较了本文方法、《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》（GB 5009.6—2016）方法（国标法）、Folch提取法对油脂和茶皂素的提取和测定的特点，可以看出本方法可以同时快速提取并测定油脂和茶皂素的含量，结合气相色谱法，还可以准确测定脂肪酸组分，需要的样品量为50 mg（表8）。国标法虽能准确测定油脂含量和脂肪酸组分，但样品需要量大，为2 000～5 000 mg，测定时间在3种方法中为最长。Folch法与本文方法相比，虽然时间上稍长0.5 h，但在100 mg样品量的条件下，Folch提取油脂的误差值大于10%，远远大于本文方法的1.34%的平均误差。综合来看，本文方法在半微量油茶种仁样品的油脂和茶皂素含量测定上具有准确度高、用时短、所需样品量少等明显优势。

3 结论与讨论

1）本研究建立了半微量油茶仁中油脂和茶皂素同步提取测定方法。第一步，油茶种仁机械破壁。称取一定质量干燥到恒质量的油茶种仁，放入MM400冷冻混合球磨仪配套的钢管中，同时加入3颗钢珠，液氮冷却到-20℃后，用冷冻混合球磨仪在10 000 r/min的条件下震荡破碎2 min。第二步，油茶种仁油脂快速提取。按照一定料液比5∶1～30∶1 mL/g，在钢管中分多次加入脂肪提取试剂盒，并将液体部分转移到脂肪提取装置中，加入0.2 mL质量浓度为10 g/L的内标物(用油脂的提取溶剂配制)，提取油脂，冷冻离心机离心（10 000 r/min，5℃），取下层溶剂，挥发掉溶剂后得到油脂样品，移取上层溶液用于茶皂素含量分析。第三步，油脂甲酯化。将油脂样品按照《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》（GB 5009.6—2016）对油脂进行甲酯化处理。第四步，油脂的GC-MS分析和数据分析。试验步骤和条件详见1.3.5中的稳定性验证。对脂肪酸甲酯混标进行采集，以单个脂肪酸甲酯的浓度为横坐标(X)，以各种脂肪酸甲酯与十七碳酸甲酯的峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归。在0.05～1.00 mg/L范围内，以单个脂肪酸甲酯的浓度与其对应的峰面积与十七碳酸甲酯的峰面积的比值为横纵坐标作图，得到单个脂肪酸的含量，进而得到总的脂肪酸含量。第五步，茶皂素含量采用香草醛-硫酸显色法结合外标法测定，参照已有文献执行。

2）最佳综合提取条件为：温度31.35℃，时间10.41 min，料液比1∶21.9 g/mL，在此条件下，油脂和茶皂素的提取率分别为99.11%和97.73%。

3）本文方法通过线性、范围、精密度、准确度验证，所有回归线的相关系数R均大于0.99，能准确测定的样品最低质量不小于50 mg，油脂和茶皂素6次测定的平均标准偏差分别为1.34%和1.74%，平均加标回收率（n=6）均在98%～102%范围，表明本文方法的线性、范围、精密度、准确度各项指标较好。

在种仁含油率26.37%～65.26%、茶皂素含量7.69 %～11.51 %的范围内，分别测定了10例50 mg油茶种仁样品的油脂和茶皂素含量，发现本文方法与国标法、Folch提取法比无统计学差异。

4）在油脂提取的过程中，组分分为3层，包括油脂层、蛋白层和茶皂素层。油脂层的密度低，处于最上层，茶皂素层的密度高，处于最底层，蛋白层位于油脂层和茶皂素层的中间，占比很小。因此，油脂和茶皂素含量如需精准测量，则取决于这两种组分能很好分离。油茶种仁中的茶皂素是一种非离子型表面活性剂，HLB值为16，很难与油脂彻底分离。然而，少量的油脂即能对茶皂素的测定产生较大干扰。因此，油茶仁中油脂和茶皂素的同步提取测定难度很大。

5）本文采用脂肪提取试剂盒来测定种子、肉类和鱼类样本中的油脂含量，包括细胞内和细胞外的油脂都能很好地提取，但对其它非脂质组分的提取率很低，基于这种差异本文巧妙设计并建立起半微量油茶种仁油脂和茶皂素含量的同步提取测定方法。与传统经典方法比较，本文方法具有准确度高、用时短、所需样品量少等明显优势，为油茶品质研究和新品种培育提供了可靠分析方法和科学依据。