基于氮掺杂石墨烯及RecJf核酸外切酶诱导信号扩增的荧光传感器检测伏马菌素B1

梁秀俊，赵凤娟，肖陈贵，贺 星，金华丽，卫 敏*

1.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001

2.深圳海关食品检验检疫技术中心，广东 深圳 518000

伏马菌素B1(Fumonisin B1，FB1)是农产品生长过程中主要由镰刀菌产生的水溶性真菌毒素。FB1多分布于以玉米为代表的谷物及制品中，能引起家畜急性中毒，损害动物免疫系统[1]。相关的研究表明，FB1的摄入与食管癌的发生具有较强的相关性[2]。为保障食品安全和公共卫生健康，对FB1的检测方法研究已成为科研人员关注的热点。其中，荧光分析方法因操作简便、无须复杂的样品前处理、分析速度快而受到青睐。作为新型“化学抗体”，核酸适配体是在体外合成的能够以高亲和力和高特异性结合目标分子的单链DNA或RNA[3]。因其具有稳定性好、易于合成、易于修饰等优点，已作为新型识别探针用于构建荧光传感器以提高检测方法的选择性及稳定性[4]。

石墨烯具有独特的吸附单链DNA (ssDNA)能力和荧光猝灭性能，在荧光传感器构建中已经得到广泛应用[5-6]。研究表明，杂原子的取代不仅能有效地调节石墨烯电子结构，改善其物理化学性质，优化其多方面的性能。由于氮原子具有与碳原子近似的原子半径和强的价键，使它成为碳基材料化学掺杂的合适选择，氧官能团被含氮酰胺基取代并形成了氮与碳原子的共价键，生成的氮掺杂石墨烯(Nitrogen doped graphenes, NDGRs)，表现出诸多优良的性能，例如，Siddiqui等[7]基于NDGRs对荧光染料罗丹明B (RhB)的吸附作用，建立检测过氧化氢浓度的传感策略，实验结果表明NDGRs增强了荧光淬灭和吸附能力，所建立的传感策略表现出良好的特异性。Dou等[8]采用DNA模板原位合成方法，在NDGRs上原位生长AuNPs，材料的分散性和催化活性显著提高，所构建的传感器用于监测活癌细胞释放的一氧化氮，体外监测能达到亚摩尔级别的检测限。目前，氮掺杂石墨烯与核酸适配体结合用于构建荧光传感策略的研究还未见报道。RecJfExo是一种从5′到3′方向剪切ssDNA特异性核酸外切酶，它还能从5′末端逐步水解适配体靶标复合物中的DNA链[9]。这一特性已被用来开发高灵敏度适配体传感器，实现信号放大策略。

作者结合核酸适配体亲和性高、特异性强、稳定性好、成本低的特点，借助RecJfExo催化剪切核酸适配体/靶标复合物的能力实现信号扩增，建立分析步骤简单、灵敏度与稳定性较高的新型荧光传感器分析方法，用于FB1的检测研究。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

FB1的核酸适配体 (FAM-Aptamer)：5′-FAM- ATA CCA GCT TAT TCA ATT AAT CGC ATT ACC TTA TAC CAG CTT ATT CAA TTA CGT CTG CAC ATA CCA GCT TAT TCA ATT AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3′ ，由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。FB1和RecJf外切酶分别购买于Acros公司和北京纽英伦生物科技有限公司。试验所用的荧光仪器为日立F-7100荧光分光光度计。

1.2 试验方法

1.2.1 传感器的制备及对FB1的荧光检测

NDGRs的制备参照参考文献[10]。将一定量的石墨烯与三聚氰胺按物质的量1∶ 1混合后置于管式炉，在氮气氛围下800 ℃处理2 h，冷却至室温，即可得到NDGRs。

将25 μL、40 μg/mL的NDGRs溶液与10 μL、1 μmol/L的FAM-Aptamer探针混合，并于37 ℃下温和振荡孵育30 min，使FAM-Aptamer探针吸附到NDGRs表面。孵育完成后向上述体系中同时加入10 μL、1 000 ng/mL的FB1与5 μL、1 U/μL RecJfExo，使用1×NE Buffer 2缓冲液将反应体系补充至200 μL，再温和振荡孵育120 min后进行荧光扫描。设置激发波长494 nm，发射波长测量范围500～600 nm，记录520 nm下的荧光强度。F0表示测量体系在不加入FB1时所获得的荧光强度，F表示加入FB1时所获得的荧光强度。

1.2.2 实际样品检测

将未受污染的玉米样品经研磨制成粉末，取5.0 g粉末并加入不同浓度的FB1，然后与25 mL萃取溶剂(甲醇与水的体积比为7∶ 3)混合，置于振荡器振荡30 min后，将所得物以5 000 r/min离心10 min，用0.45 μm有机滤膜过滤上清液，使用1×NE Buffer 2缓冲液将滤液稀释至100倍。根据上述预处理方法，分别制备出5 ng/mL、50 ng/mL和500 ng/mL的FB1加标玉米样品提取液。

取适量的啤酒于100 mL烧杯中，将其充分超声处理去除二氧化碳等气泡。称取5 mL啤酒样品与不同质量浓度的FB1溶液混合于50 mL离心管中，加入20 mL的1×NE Buffer 2缓冲液，充分混合后直接用0.45 μm的水系滤膜过滤，并收集样品处理滤液。取适量样品处理滤液并用1×NE Buffer 2缓冲液将上清液稀释至100倍，制备5 ng/mL、50 ng/mL和500 ng/mL的FB1加标啤酒样品提取液。

2 结果与分析

2.1 基于NDGRs与RecJf Exo的荧光传感器对FB1的检测原理

如图1所示，当传感体系中不存在FB1时，NDGRs既是作为负载FB1核酸适配体识别探针FAM-Aptamer的物理基底，也是一种荧光猝灭材料。单链FAM-Aptamer核酸碱基芳香环结构和NDGRs结构六角晶胞间产生强烈的π-π堆积作用，使其能够吸附在NDGRs表面，荧光基团靠近NDGRs导致其荧光猝灭[11]。当加入FB1时，FB1与FAM-Aptamer特异性结合，FAM-Aptamer的构象发生变化并从NDGRs表面脱离形成FAM-Aptamer/FB1复合物，FAM基团远离NDGRs，其荧光强度就会恢复。利用RecJfExo特异性剪切FAM-Aptamer/FB1复合物中单链FAM-Aptamer的能力，FAM-Aptamer被水解从而释放出FB1，同时因FAM-Aptamer被水解成了单核苷酸片段[12]，FAM荧光基团也游离于传感体系之中。释放出的FB1再次和吸附于NDGRs表面的FAM-Aptamer发生特异性结合，形成下一次循环。RecJfExo的剪切靶标复合物的循环作用使得游离于传感体系的FAM荧光基团增多，导致荧光信号明显增大。

图1 基于NDGRs与RecJf Exo的传感器制备检测FB1原理

2.2 NDGRs的表征

利用扫描电镜和透射电镜对制备的NDGRs进行形貌表征，结果如图2所示。可以看出NDGRs的薄片层状结构清晰明显，表面存在略微褶皱，大小为1～2 μm。

图2 氮掺杂石墨烯的扫描电镜形貌和透射电镜形貌

利用X射线光电子能谱(XPS)对NDGRs进行物质元素的定性分析，结果如图3所示。可以看出，材料中含有C、N、O 3种元素，531 eV、399 eV和285 eV处的信号峰分别代表O 1 s、N 1 s和C 1 s。此外，N 1 s光谱在401.5、400.1和398.7 eV处有3个峰，分别对应于石墨-N、吡咯-N和吡啶-N。XPS分析表明，部分N元素已经嵌入到NDGRs材料结构中，N含量约为5.53%。

图3 NDGRs的X射线光电子能谱(XPS)分析

2.3 NDGRs的用量对FAM-Aptamer荧光探针猝灭性能的影响

NDGRs的用量对FAM-Aptamer荧光探针猝灭性能的影响如图4所示。从图4 A可看出，随着材料质量浓度的增加，猝灭效率逐渐增加，所获得的荧光强度逐渐减弱最终趋于平缓。当NDGRs质量浓度达到40 μg/mL时，超过80%的荧光信号被淬灭，说明使用较多的NDGRs可使单链FAM-Apatmer信号探针被更有效地吸附到材料表面。猝灭效率随NDGRs质量浓度的继续增加而增加，当质量浓度达到60 μg/mL之后不再明显变化。但是，当浓度超过40 μg/mL时，会影响其分散性及稳定性，并且由光散射所产生的信号干扰可能会使传感器的灵敏度降低[13]。图4B显示不同系列质量浓度NDGRs存在下加入FB1前后所获得的荧光强度。内插图为按照(F-F0)/F0计算不同的NDGRs质量浓度下相对荧光强度比值。可以看出，随着NDGRs质量浓度的增加，测量体系的相对荧光强度比值先增大后减小，当NDGRs质量浓度为40 μg/mL时，由FB1引起的相对荧光强度比最大。内插图也反映出使用适当多的NDGRs可以更加有效地吸附单链FAM-Aptamer，提高猝灭效率。然而，过量的NDGRs可能会在FAM-Aptamer/FB1复合物周围，导致荧光强度降低[14-15]。因此，NDGRs的最佳质量浓度为40 μg/mL。

2.4 RecJf Exo用量的优化

对RecJfExo的用量进行优化，结果如图5所示。荧光强度随着酶用量的增加而逐渐增加，当酶量为5 U时达到最大。这可能是由于适配体靶标复合物被催化剪切的效率有所增加，导致越来越多的FAM荧光基团被释放到传感体系中。因此，RecJfExo的最佳用量为5 U。

2.5 传感器对FB1的检测

利用所制备的荧光传感器对FB1检测，结果如图6所示。在传感体系中仅有NDGRs与FAM-Aptamer信号探针孵育后，得到的荧光强度较低(曲线a)，说明NDGRs对信号探针起到了明显的荧光猝灭，猝灭现象的发生可能主要是由于FAM荧光基团与NDGRs之间的FRET效应引起的。同时也表明了大量的FAM-Aptamer信号探针被有效吸附到NDGRs表面。在NDGRs与FAM-Aptamer信号探针孵育后，加入RecJfExo孵育2 h，荧光强度仅略微增加 (曲线b)，说明大部分的FAM-Aptamer仍负载于NDGRs表面，RecJfExo几乎没对信号探针进行水解。该现象证明了NDGRs保护单链寡核苷酸免受RecJfExo剪切的特性。当完成NDGRs对FAM-Aptamer信号探针负载后，向传感体系中引入FB1，经30 min孵育后，与未加入FB1时相比，荧光强度增加了64.7% (曲线c)。说明核酸适配体对FB1的高亲和力诱导探针形成了FAM-Aptamer/FB1复合物，并导致复合物从NDGRs材料表面脱离，FAM基团荧光恢复。而当NDGRs与FAM-Aptamer信号探针孵育完成后向传感体系中同时加入FB1与RecJfExo，得到的荧光强度相较于曲线c的荧光信号强度又进一步地增加了80.1%(曲线d)，此现象说明RecJfExo可以有效剪切FAM-Aptamer/FB1复合物中ssDNA，FAM-Aptamer/FB1复合物解体，FAM荧光基团与FB1均游离于传感体系之中，被释放的FB1会重复参与结合负载于NDGRs表面的FAM-Aptamer，进而导致更多的FAM荧光基团因信号探针被剪切而游离于传感体系之中，说明RecJfExo剪切适配体靶标复合物引起的靶标循环信号扩增作用有显著效果。

A.不同质量浓度NDGRs与FAM-Aptamer孵育完成后所对应的荧光强度；B.不同质量浓度NDGRs条件下，NDGRs/FAM-Aptamer测量体系中加入FB1孵育前后的荧光强度 (内插图为NDGRs质量浓度与相对荧光强度比的关系)

[FAM-Aptamer]=1 μmol/L；[NDGRs]=40 μg/mL；[FB1]=50 ng/mL

a.40 μg/mL NDGRs+1 μmol/L FAM-Aptamer；b.40 μg/mL NDGRs+1 μmol/L FAM-Aptamer+5 U RecJf Exo；c.40 μg/mL NDGRs+1 μmol/L FAM-Aptamer+50 ng/mL FB1；d.40 μg/mL NDGRs+1 μmol/L FAM-Aptamer+50 ng/mL FB1+5 U RecJf Exo

由图7可以看出，随着FB1质量浓度的增加，荧光强度逐渐增加。当FB1的质量浓度达到500 ng/mL以后，荧光强度未明显变化。FB1质量浓度在0.2～20 ng/mL及20～500 ng/mL范围内呈线性关系，线性方程分别为F=9.02CFB1+192.27 (R2=0.991 5)和F=0.35CFB1+367.71 (R2=0.992 1)，检出限为0.084 ng/mL (3σ)。与其他文献的检出限比较见表1。

2.6 传感器的特异性研究

利用赭曲霉毒素A(OTA)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)对所制备传感器的特异性进行研究。 FB1质量浓度10 ng/mL，其他干扰毒素OTA、AFB1、ZEN的质量浓度均为500 ng/mL。从图8可以看出，尽管添加其他干扰毒素的浓度是FB1的50倍，但都不能引起传感器显著的信号响应，而只要传感体系中存在FB1，荧光强度就有明显增加，说明该传感器具有良好的特异性。

曲线由下至上FB1质量浓度依次为0、0.1、0.2、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL

表1 所制备传感器与其他检测FB1方法比较

(a)空白；(b)AFB1；(c)OTA；(d)ZEN；(e)FB1；(f)FB1+AFB1；(g)FB1+OTA；(h)FB1+ZEN；[FB1]=10 ng/mL；[AFB1]=[OTA]=[ZEN]=500 ng/mL

2.7 实际样品检测

利用所制备的传感器对FB1加标玉米及啤酒检测，结果如表2所示。加标玉米样品中FB1的平均回收率为91%～103%，加标啤酒样品中FB1的回收率为92%～97%，说明制备的传感器适用于食品中FB1的检测。

表2 FB1加标样品的检测结果 (n=6)

3 结论

利用具有较大比表面积及良好分散性的NDGRs有利于增强传感器检测性能的优点，将其作为负载FB1核酸适配体识别探针的基底，建立了以RecJfExo催化剪切FAM-Aptamer/FB1复合物中单链FAM-Aptamer释放FB1，触发靶标循环信号扩增传感策略，实现了FB1的高灵敏检测。同时，该传感器对加标玉米及加标啤酒样品的检测得到良好的回收率。