种眼影微生物检验方法挑战性试验研究

＊牟建平 滕宝霞 贺晓文 朱玲 肖静 曾小梅

（甘肃省药品检验研究院 甘肃 730070）

《化妆品安全技术规范》2015年版中对微生物检验进行方法和限值规定[1]，眼影由于含有着色颜料、珠光颜料、酯类基质和抑菌剂等[2]，影响微生物的检出，本文对4种眼影分别加入阳性指示菌[3]，进行微生物检验方法挑战性试验，通过计数方法回收率、控制菌生长试验，建立4种眼影（NOVO键盘指尖酷潮眼影星辰11#、希貝单色钻石眼影41#、希貝单色钻石眼影14#和希貝单色钻石眼影18#）的微生物检验方法，为其他类别的眼影微生物检验提供参考。

1.试验材料

(1)样品

NOVO键盘指尖酷潮眼影星辰11#，批号：AL528001，规格1.8g；希貝单色钻石眼影41#浅粉色，批号：XB17111685，规格1.8g；希貝单色钻石眼影14#宝蓝色，批号：XB18051 685，规格1.8g；希貝单色钻石眼影18#绿色，批号：XB18 051685，规格1.8g。

(2)培养基

卵磷脂吐温80营养琼脂，批号：190221；SCDLP液体培养基，批号：180202；孟加拉红琼脂，批号：180119；双倍乳糖胆盐培养基（含中和剂），批号：180609；Baird-Parker培养基基础，批号：190122；甘露醇发酵培养基，批号：180811；伊红美蓝琼脂（EMB），批号：190827；十六烷三甲基溴化铵琼脂，批号：190813；pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液，批号：20200312，均购于北京陆桥技术股份有限公司。

(3)菌种

大肠埃希菌（ATCC 8739）、铜绿假单胞菌（ATCC 278 53）、枯草芽孢杆菌（ATCC 6633）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、白色念珠菌（ATCC 10231）和黑曲霉（ATCC 16404）购于中国食品药品检验研究院。

(4)仪器设备

生物安全柜（ESCD、CLASS11BSC）、生化培养箱（上海一恒、BPMJ-250F）、压力消毒器（松下、MSL-3781L-PC）、恒温水浴锅（杭州米欧仪器有限公司、WT100-2）、显微镜（奥林巴斯、BX53+DP74）。

2.方法与结果

(1)菌种

试验所用菌种为第3代，菌悬液为第4代。

(2)供试液制备

称取眼影5g加到灭菌的三角瓶中，加入5ml灭菌吐温-80，加入pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液至100ml，置于45℃水浴中，用匀浆仪混匀2分钟，制成1:20供试液。

(3)计数方法验证

加入5种阳性指示菌，采用1:20供试液1ml注皿、1:100供试液1ml注皿，计算回收率试验，进行微生物计数检查方法的筛选。指示菌回收率结果见表1。

表1 计数方法适用性试验回收率

结果采用1:20供试液1ml注皿，NOVO键盘指尖酷潮眼影星辰11#供试品铜绿假单胞菌回收率试验低于50%，对铜绿假单胞菌有抑制作用，希貝单色钻石眼影41#供试液对铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌回收率低于50%，有抑制作用，采用1:100供试液1ml注皿，回收率大于50%，方法可行；希貝单色钻石眼影14#和18#采用1:20供试液1ml注皿，5种阳性指示菌回收率均大于50%，方法可行。

(4)控制菌方法适用性试验

①耐热大肠菌群耐热大肠菌群系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌，在44.5℃培养24～48h能发酵乳糖产酸并产气，采用《化妆品安全技术规范》2015年版耐热大肠菌群常规方法进行实验[1]，可以检出试验菌大肠埃希菌，方法可行。结果见图1，表2。

图1 耐热大肠菌群挑战性试验

表2 控制菌（耐热大肠菌群）方法适用性试验

②金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽孢，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性，采用 《化妆品安全技术规范》2015年版金黄色葡萄球菌常规方法进行实验[1]，可以检出试验菌金黄色葡萄球菌，方法可行。结果见表3。

表3 控制菌（金黄色葡萄球菌）方法适用性试验

③铜绿假单胞菌属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42℃条件下能生长，采用《化妆品安全技术规范》2015年版铜绿假单胞菌常规方法进行实验[1]，可以检出试验菌铜绿假单胞菌，方法可行。结果见表4。

表4 控制菌（铜绿假单胞菌）方法适用性试验

3.结论

（1）NOVO键盘指尖酷潮眼影星辰11#和希貝单色钻石眼影41#样品微生物检验方法，计数方法中菌落总数采用1:100供试液1ml注皿，霉菌和酵母菌总数采用1:20供试液1ml注皿，控制菌采用常规方法检验。

（2）希貝单色钻石眼影14#和希貝单色钻石眼影18#样品微生物检验方法，计数方法菌落总数、霉菌和酵母菌总数均采用1:20供试液1ml注皿，控制菌采用常规方法检验。