ELISA方法检测奶牛结核病的效果评价

徐峥嵘

(甘肃省动物疫病预防控制中心，兰州 730000)

1 材料与方法

1.1 试验设备及材料

试验动物：试验所用实验动物均为做过PPD变态反应的奶牛，共计350头。

试验试剂：牛分枝杆菌重组抗原，采购自哈尔滨兽医研究所；牛结核病标准阴性血清，牛结核病标准阳性血清，均采购自哈尔滨兽医研究所。

其他所需试剂：兔抗牛IgG-HRP(辣根过氧化物酶)工作液、柠檬酸—磷酸盐片、邻苯二胺(OPD)、3%H2O2、磷酸盐—吐温缓冲液PBST、氯化钠、浓硫酸等。

试验仪器及耗材：高速冷冻离心机、酶标仪680型、恒温箱、微量移液器、高压灭菌锅、电子天平、低温冰箱、容量瓶、烧杯、移液器、量筒、广口瓶、锥形瓶、离心管、TIP头、采血管、手术剪、镊子、一次性聚乙烯手套、口罩、乳胶手套、记号笔、标签纸、酒精棉球、计时器、报纸、棉线等。

1.2 牛结核病ELISA检测方法操作步骤

1.2.1 抗原包被 首先用碳酸缓冲溶液按照1∶600的比例将牛分枝杆菌重组抗原进行稀释，然后依次加入50 μL稀释抗原溶液与96孔微型板上，对照组加碳酸盐缓冲溶液，振荡混匀，加样过程中每加一个孔必须换一个TIP头。用封板膜封板后，放置于37 ℃恒温箱内，静置90 min。

1.2.2 洗 板 慢慢揭开封板膜，将96孔微型板中的抗原包被液弃去，甩干之后在每孔加满配制好的PBST溶液，吹吸混匀，静置30 s后弃去，如此重复5次，最后在吸水纸上用力拍干，使洗液残留量程度达到最低。

1.2.3 洗 板 洗板方法同1.2.2，反复洗板5次，拍干反应板中的残留液体。

1.2.4 加牛血清 将待检奶牛血清稀释1∶200倍，用微量移液器加入到96孔微型板中，每孔50 μL，充分吹吸混匀。分别设置阳性对照孔和阴性对照孔各2个，将阳性、阴性血清稀释1∶100倍稀释，用微量移液器吸取50 μL稀释液分别加入到96孔微型板相应对照孔内，放置于37 ℃恒温箱内，静置60 min。

1.2.5 洗 板 洗板方法同1.2.2，反复洗板5次，拍干反应板中的残留液体。

1.2.6 加入兔抗牛IgG-HRP工作液 将兔抗牛IgG-HRP工作液1∶1000倍稀释，用微量移液器缓缓吸取50 μL兔抗牛IgG-HRP工作液依次加入到A1-H12每个孔中，用封板膜封板后，放置于37 ℃恒温箱内，孵育60 min。

1.2.7 洗 板 洗板方法同1.2.2，反复洗板5次，拍干反应板中的残留液体。

1.2.8 加入底物溶液和终止液 加入配制好的底物溶液，用微量移液器缓缓吸取50 μL，按顺序加入到96孔微型板每个孔内，轻轻振荡混匀，用封板膜封板后，放置于37 ℃恒温箱内，孵育15 min。

待上一步骤完成之后，按照之前加入底物溶液的顺序，迅速在每孔加入50 μL的终止液，用微量振荡器混匀孔内液体，终止反应。

1.3 测 定

开启多功能酶标仪，在492 nm波长下，读取每孔的吸光度值，同时用Excel表格记录数据，便于后期进行数据统计分析。

1.4 结果判定

根据公式S/P=(S-N)/(P-N)计算判定值，其中S代表样品OD值；P代表阳性血清OD值；N代表阴性血清OD值。依据计算结果，进行结果判定。

(1)阳性反应：S/P≥0.5。

(2)疑似阳性：0.4

(3)阴性反应：S/P<0.4。

2 PPD与ELISA检测试验结果

用ELISA检测的350份奶牛血清样品，同时进行了PPD皮内变态反应试验，检测结果见表1。由表1试验结果可以看出，检测的350头奶牛中，经ELISA检测结果检出：呈阳性数量为2头，阳性符合率为25%(2/8)；呈阴性数量为306头，阴性检出率为89.47%，阴性符合率为89.47%(306/342)，总符合率为88%(308/350)。两种检测方法的检测结果表明，所检测奶牛场的结核杆菌感染率较低，且PPD皮内变态反应的阳性检出率高于抗体ELISA检测结果，表明其敏感性高于抗体ELISA试验。

表1 ELISA检测结果与PPD结果比较

3 结 论

目前，我国对奶牛结核病的检测多采用PPD皮内变态反应法，该检测方法是国家标准，同时也被国际贸易方指定的检测方法之一[1]。但单纯使用PPD皮内变态反应法作为检测奶牛结核病的标准检测方法，效果并不是十分理想。首先，此方法存在的误差较大，在大规模检测中，容易出现阳性漏检情况；其次，PPD皮内变态反应容易出现假阳性的试验结果，考虑造成此种现象的原因，可能与PPD本身的产品质量有关[2]。而ELISA作为现代血清检测的主要方法，其操作简单、耗时短、误差小，适合短时间内对大规模流行病学调查，但由于牛结核分枝杆菌的复杂性，导致其阳性检出率低于PPD。因此，要彻底净化奶牛结合病，必须要将两种方法有效结合，取长补短，才能为临床牛结核病的防治工作提供准确的数据支持。