福建省七叶一枝花细菌性软腐病病原鉴定

郑梅霞，苏海兰，肖荣凤，何桂强，朱育菁 *

（1. 福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建 福州 350003；2. 井冈山自然保护区长古岭林场，江西 井冈山 343600）

0 引言

【研究意义】七叶一枝花［Paris polyphylla Smith var. chinensis（Franch.）Hara］属百合科重楼属植物，是历版《中国药典》收载的两种重楼药材基原植物之一[1−3]。七叶一枝花根茎药用历史悠久，具有抗肿瘤、抗菌消炎等作用[4]。七叶一枝花人工种植过程中会出现软腐病、叶斑病、茎腐病、根腐病等病害[5]，严重影响产量和质量[6−9]。分析病害的发生特点，鉴定七叶一枝花病害的病原菌，对充分了解七叶一枝花病害从而采取针对性的防治措施具有重要意义。【前人研究进展】马维思等[1]对滇重楼软腐病菌进行分离鉴定，其致病菌为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种Pectobacterium carowvorum subsp. carotovorum。赵振玲等[10]对滇重楼的叶斑病进行分析，是由半知菌类的柱隔孢（Ramularia）引起的真菌性病害。滇重楼的根腐病主要由多种因素综合引起，发生率一般为50%，严重可达87.7%[11]。【本研究切入点】目前，在福建省光泽县七叶一枝花主要产区出现了软腐病，造成生育期的七叶一枝花植株叶片腐烂、茎秆开裂、植株倒伏和块茎腐烂，田间发病率约为5%～45%。已对七叶一枝花种植形成较大威胁。该病害在我省发生的情况还缺乏了解，尚无有效的防治方法。【拟解决的关键问题】本研究对七叶一枝花软腐病的发生特点进行调查，并对病原菌进行分离鉴定，以期为该病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

七叶一枝花软腐病病株于2018～2019年采自福建省光泽县福建承天农林科技发展有限公司重楼规范化栽培基地。

LB：蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1000 mL，琼脂17.5 g，调节pH值至7.0～7.2。主要试剂：无菌水、STE Buffer、Tris-平衡酚、氯 仿、TE Buffer。

1.2 方法

1.2.1 田间病害调查 2018—2019年，在福建省光泽多个七叶一枝花种植基地，采用田间调查法观察发病植株的症状，了解七叶一枝花软腐病的发生情况 和发病特点。

1.2.2 病原菌分离纯化和保存 采用组织分离法进行病原菌的分离和纯化。采集刚发生软腐病的新鲜七叶一枝花叶片、茎秆，自来水冲洗干净植株表面泥土后，酒精棉球擦拭干净，将植株组织先用消毒后的刀片切去表皮，然后切病健交界处大小约为2 mm×2 mm×1 mm的薄片。将切成片状的病组织在75%的酒精溶液中浸泡30 s，然后在1%的次氯酸钠溶液中浸泡消毒5～8 min后，用无菌水漂洗3次，将植物组织片贴到LB平板表面，25 ℃倒置培养2 d，待培养物长出，采用稀释划线转接到新的培养皿中。纯化两次，以甘油∶LB液=1∶4的比例存放在 −80 ℃冻保存。

1.2.3 致病性测定 由于该植物对生长条件要求较为严格，室内条件不容易培养，于4—5月选在田间独立栽种的盆苗中处理，取16株长势一致的7年生七叶一枝花，自来水冲洗去除表面泥土，分析选择叶片或茎秆用毛刷把10−6cfu·mL−1浓度的菌液刷在表面，处理后的叶片与茎杆用湿纱布包住，培养2 d后，去除纱布继续培养，以无菌水处理作为对照，观 察发病情况。

1.2.4 病原菌鉴定 形态特征：经致病性测定确认病原细菌后，透射电镜观察菌体特征。分子鉴定：利用细菌基因组提取试剂盒对纯化菌株的菌液提取基因组，利用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3'和1429R：5'-GGTTACCTTGTTACGA-3'聚 合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）扩增该菌株的16s rDNA片段，然后将 PCR 产物电泳后回收，送由基因公司测序[12]。将测序结果用 Blast 与NCBI 中的Gene Bank 数据库中近缘菌株的 16 SrDNA进行同源性比对，使用 MEGA7 软件进行系统进化树的 构建。

2 结果与分析

2.1 七叶一枝花软腐病的特点及危害

七叶一枝花为草本宿根植物，一年出苗一次。从每年2月植株出苗开始，多雨时节可观察到在叶片、茎秆和块茎均有软腐病发生，并且地温在20 ℃～25 ℃或在25 ℃以上，通气不良、田里积水，利于病害发生发展。软腐病主要危害部位为叶片和茎部，叶片发病初期在受害部位出现水浸状的坏死，病部很快扩大，感病部位内部组织被细菌分解成液体状态，病组织开始软化、变色，病斑边缘初有明显界限，随着病势的发展界限逐渐模糊不清，然后软腐（图1-a、b）。茎秆发病初期在茎秆基部形成水浸状病斑，后软化，茎内部开始腐烂，产生刺激性臭味，发病部位沿着维管束向上蔓延造成整个茎秆稀软腐烂，叶片萎蔫、植株倒伏（图1-c）。随着病情的蔓延，七叶一枝花块茎也会受到软腐病的危害，软腐组织呈棕褐色，被侵染组织和健康组织界限明显，病斑边缘有褐色或黑色的色素。腐烂早期无气味，二次侵染后有臭气、黏液、黏稠物质（图1-d）。

图 1 七叶一枝花植株软腐病发病症状Fig. 1 Symptoms of soft rot disease on P. polyphylla

2.2 致病性测定

植株接种后，接种叶片的植株第4 d开始发病，并逐渐向四周扩散蔓，于第7 d蔓延至全叶和茎杆，叶片呈水渍状（图2-a和图2-b）。接种茎杆的植株第3 d开始发病，并逐渐向四周扩散蔓延，于第5 d导致茎杆开裂，内部腐烂和软腐，有菌浓流出（图2-c）。从发病的组织中再次分离获得的细菌，经形态学和分子鉴定，证明与所接病原菌一致。

图 2 七叶一枝花植株人工接种致病症状.Fig. 2 Symptoms of soft rot disease on artificially inoculated P.polyphylla plant

2.3 病原菌形态特征

该菌在肉汁冻培养基上菌落圆形、光滑、乳白色、半透明，菌落边缘光滑或呈波状，菌落中央有略带乳黄色的瘤状突起（图2）。七叶一枝花植株软腐病病原细菌的透射电镜扫描图如图3所示，菌体为两端钝圆呈短杆状，大小1.4～2.4（平均1.6）μm × 0.4～0.6（平均 0.5）μm，具有2～8 根周生鞭毛（图4）。

图 3 植株软腐病病原菌的菌落形态Fig. 3 Morphology of soft rot pathogen colonies

图 4 植株软腐病病原细菌形态特征Fig. 4 Morphology of soft rot pathogen

2.4 病原菌分子鉴定

代表性菌株FJAT-49333经16SrDNA测序，并在NCBI 中的Gene Bank 数据库中近缘菌株的 16 SrDNA进行比对发现与Pectobacterium carotovorum同源性均达到99%以上，发育树图如图5所示。根据病原菌的形态特征，16S rDNA鉴定和致病性实验，可将七叶一枝花软腐病的病原菌鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum。

图 5 七叶一枝花植株软腐病病原细菌的发育树Fig. 5 Pathogenic bacteria development tree of soft rot disease on P. polyphylla

3 讨论与结论

七叶一枝花作为一种驯化时间较短的药用植物，随着人工种植种植面积的不断增加，各种病害问题日渐凸显[13−15]。细菌性软腐病是世界性的重要细菌性病害之一，除危害白菜、甘蓝、萝卜、花椰菜等十字花科蔬菜外，还危害马铃薯、番煎、辣椒、大葱、洋葱、胡萝卜、序菜、莴苣等煎科、豆科、伞形科和葫声科的多种蔬菜以及马蹄莲、鸾尾、唐菖蒲等观赏植物[16]。胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum会引起茄子、番茄、辣椒和芹菜等多种作物发生软腐病[17−19]，该类细菌性软腐病是世界性重要病害之一[20−22]。胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum寄主范围和地理分布广泛，是自然条件下普遍存在的植物病原菌，能侵染数百种蔬菜以及一些花卉植物，细菌性软腐病具有发生范围广和难以防治的特点[23−24]。杨钟灵等[19]研究表明，胡萝卜软腐果胶杆菌可以引起黄花马蹄莲的软腐病。晋知文等[25]研究表明，胡萝卜软腐果胶杆菌可以引起芹菜软腐病。

本研究首次分离鉴定了七叶一枝花软腐病的病原菌，为胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum。通过对七叶一枝花细菌性软腐病的分离与鉴定以及对七叶一枝花软腐病发生时进行田间调查，明确了其致病菌为胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovoru。田间栽培时应注意加强通风、清除积水，及时清除病株，以减轻田间七叶一枝花软腐病的发生和蔓延。本研究对下一步研究七叶一枝花细菌性软腐病的有效防治方法提供前期理论基础。