川续断皂苷Ⅵ对小鼠成肌细胞成骨分化的影响

朱 珠，张 玮

骨质疏松症是一种常见的骨骼疾病，常发生于老年人、绝经后或雌激素缺乏的妇女，其主要特点是骨重建率高，骨吸收率高于骨形成率[1]。骨质疏松症增加了骨折的风险，并可能导致高昂的医疗费用，该病的防治越来越受到重视。目前对这种疾病的治疗主要是药物治疗，如降钙素、双膦酸盐、选择性雌激素受体调节剂和人单克隆抗体[2-5]。然而，这些药物的使用增加了颌骨骨坏死、中风和癌症的风险[6-7]。因此，有必要寻找更安全、更有效的抗骨质疏松药物。

间充质干细胞是一种多能干细胞，具有分化成各种组织的潜能，如成骨细胞，通常从骨髓和骨外间充质中分离出来。小鼠成肌细胞(C2C12)就是其中一种，因其在体内分布广泛、易于获得而常被用作研究骨外间充质细胞向成骨细胞分化的模型细胞系[8-9]。

从植物中提取的天然化合物是潜在的抗骨质疏松药物的资源。川续断是多年生草本续断的干根，生长在我国湿润的田野和山区，是我国长期安全使用的补肾中药，用于治疗骨折和关节疾病[10]。川续断皂苷Ⅵ(Asperosaponin Ⅵ，ASA Ⅵ)是川续断最主要的生物活性成分，具有多种有益的特性，包括神经保护、预防骨质疏松、预防心肌梗死、抗凋亡和镇痛等[11-13]。然而，到目前为止，还没有关于ASA Ⅵ对C2C12细胞成骨作用的报道，因此本研究试图采用C2C12细胞作为研究模型来探讨ASA Ⅵ对其的作用及影响。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂

ASAⅥ(纯度>99%，中国药品生物制品检定所)溶解在二甲基亚砜溶液(DMSO)中，并在-20 ℃下储存。DMEM培养基，抗坏血酸磷酸酯、β-甘油磷酸酯、地塞米松和茜素红(Sigma公司，美国)，胎牛血清(FBS)(Invigentech，美国)，Trizol试剂(诺唯赞生物科技有限公司，南京)，细胞计数试剂盒8(CCK-8)(新赛美公司，苏州)，ALP活性试剂盒(建成，南京)，BCA蛋白质分析试剂盒(碧云天，上海)，PVDF膜(Millipore，德国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和成骨分化 C2C12细胞购自美国菌种保藏中心(ATCC，美国)。细胞在含有10% FBS和1%青霉素和链霉素(碧云天，上海)的DMEM中培养，放入5% CO2、37 ℃的培养箱孵育。成骨培养基(1 mmol/L地塞米松、1 mol/L β-甘油磷酸和10 mmol/L L-抗坏血酸)诱导成骨分化。

1.2.2 细胞活力测定 细胞接种在96孔板中，密度为1×103个细胞/孔。每孔含100 μL培养基，37 ℃孵育。24 h后，用不同剂量的ASA Ⅵ(0、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7和1×10-8mol/L)处理细胞，每个浓度设置3个复孔，对照组用DMSO处理。培养1、2、3 d后，使用CCK-8测定细胞活力。在450 nm处用分孔分光光度计测定吸光度。每次实验均重复3次。

1.2.3 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性测定 将细胞与不同浓度的ASA Ⅵ(0、1×10-5、1×10-6、1×10-7和1×10-8mol/L)一起接种在24孔板(2×103个细胞/孔)中，每个浓度设置3个复孔。在成骨诱导4 d或7 d后，用0.2%Triton X-100(碧云天，上海)在冰上裂解细胞，然后在4 ℃条件下，以14 000 r/min离心15 min。收集上清液，使用ALP活性试剂盒检测ALP活性，并使用BCA蛋白质分析试剂盒测量蛋白质浓度，筛选出促进C2C12细胞成骨分化的最佳作用浓度。

1.2.4 茜素红染色 将细胞接种在含有或不含ASA Ⅵ(促ALP活性的最佳作用浓度)的成骨培养基中，每3 d换1次培养基。到第7天时，细胞用PBS洗涤两次，用98%乙醇固定20 min。然后，再次用PBS洗涤，每孔加入适量茜素红溶液，37 ℃孵育15 min，镜下拍摄钙结节。

1.2.5 实时定量PCR检测 采用实时PCR检测显著的成骨分化相关标记基因，包括碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(Ocn)、1型胶原α1(Col1α1)和Runt相关转录因子2(Runx2)的表达水平。将细胞接种于6孔板(4×104个细胞/孔)和ASA Ⅵ(促ALP活性的最佳作用浓度)的成骨培养基中，每个浓度设置3个复孔。在成骨诱导7 d后，使用Trizol试剂提取总RNA，对ALP、Ocn、Col1α1和Runx2进行cDNA合成。β-actin作为内参。

1.2.6 免疫印迹分析 如前所述，成骨诱导条件下培养7 d后，用PBS洗涤3次，用RIPA缓冲液(碧云天，上海)在冰上裂解，然后在12 000 r/min离心5 min。收集上清液，并使用BCA蛋白质分析试剂盒测定蛋白质浓度；50 μg蛋白质煮沸10 min，通过SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上。在TBST缓冲液中用5%BSA封闭膜，在4 ℃下与一级抗体孵育过夜。在TBST中洗涤膜3次15 min，并在室温下与二级抗体孵育30 min。用曝光机测定实验带的吸光度值与β-actin吸光度的关系。

1.3 统计与方法

所有实验均至少重复3次，用单因素方差分析比较各组间的差异。P<0.05被认为具有统计学意义。

2 结 果

2.1 ASA Ⅵ对C2C12细胞增殖的影响

ASAⅥ诱导1、2和3 d后，1×10-3、1×10-4mol/L组明显抑制细胞增殖，对细胞有一定的毒性(P<0.01)，而1×10-8～1×10-5mol/L组则对细胞增殖均无明显作用(P>0.05)(图1)。

**：P<0.01

2.2 ASA Ⅵ对C2C12细胞ALP活性的影响

研究发现1×10-8～1×10-5mol/L均能促进细胞分化，但其中1×10-6mol/L促进细胞分化的效果最为明显(P<0.01)(图2)。因此后续以1×10-6mol/L为最佳促分化浓度进行实验。

*：P<0.05；**：P<0.01

2.3 ASA Ⅵ对C2C12细胞矿化的影响

采用茜素红染色法检测了ASA Ⅵ对C2C12细胞钙结节沉积的影响(图3)。与对照组相比，1×10-6mol/L组中红色标记的矿化结节数量显著增加(P<0.05)。这些数据表明，ASA Ⅵ增强了C2C12细胞的钙沉积。

A：对照组细胞钙结节沉积(肉眼观)；B：1×10-6 mol/L ASA Ⅵ组细胞钙结节沉积(肉眼观)；C：对照组细胞钙结节沉积(茜素红染色 ×10)；D：1×10-6 mol/L ASA Ⅵ组细胞钙结节沉积(茜素红染色 ×10)

2.4 ASA Ⅵ对C2C12细胞成骨分化的影响

我们在mRNA和蛋白质水平分别检测了几个成骨指标(ALP、Runx2、Ocn和Col1α1)的表达水平。与对照组相比，ASA Ⅵ组的ALP、Runx2、Ocn和Col1α1的表达量均升高(图4，P<0.05)。这些结果表明，ASA Ⅵ促进了C2C12细胞的成骨分化。

A：PCR结果，*：与对照组相比，P<0.05；**：与对照组相比，P<0.01；B：Western blot结果

3 讨 论

随着年龄的增长，老年人身体机能逐渐退化，其体内骨髓间充质干细胞的数量及成骨分化能力也降低，骨形成显著减少，最终导致骨质疏松症[14]。有文献表明，骨外间充质干细胞在一定条件下，可诱导分化为成骨细胞并发挥功能[15]，并且骨外间充质干细胞数量巨大，取材容易，创伤较小，体外培养传代增殖能力较强。其引起了组织工程领域的广泛关注，提供了一条新的成骨细胞的来源。

C2C12细胞是小鼠成肌细胞，起源于未分化的骨外间充质细胞，可诱导分化为成骨细胞。有研究表明，成纤维细胞生长因子21能促进C2C12的成骨分化，表明C2C12有向成骨细胞分化的潜能[16]。在我们的研究中，我们通过茜素红染色分析发现明显的钙结节，这表明C2C12具有向成骨细胞分化的能力，为我们的研究提供了良好的模型。

ASAⅥ是传统中药川续断的主要活性成分之一[17]，药理作用广泛。有文献报道，ASA Ⅵ有较强的抗炎作用，并可用于开发治疗疼痛和炎症相关疾病的药物[18]；ASA Ⅵ还通过抑制氧化应激诱导的内皮细胞凋亡信号通路，来抑制ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的发生，可能是一种潜在的动脉粥样硬化防治药物[19]；也有研究发现，ASA Ⅵ对神经元细胞PC12细胞中淀粉样β诱导的细胞毒性具有神经保护作用[20]，而且ASA Ⅵ不仅可以改善阿尔茨海默症相关的炎症，还可以改善记忆障碍[21]；此外，ASA Ⅵ抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的磷酸化，暗示这一途径可能与ASA Ⅵ的神经保护机制有关[22]。这些研究都表明ASA Ⅵ有较高的研究和开发价值。

在传统中医学中，ASA Ⅵ常被用来治疗肾脏和骨骼疾病。此前，有文献报道，ASA Ⅵ可以通过抑制破骨细胞的形成，减轻骨质疏松引起的关节炎[23]。也有研究表明，ASA Ⅵ可促进成骨细胞分化，提高成骨细胞的活性和数量，促进基质钙化、骨痂生长，从而防止骨质疏松、促进骨折的愈合[24]。综上所述，ASA Ⅵ既能增加骨形成，同时也能抑制骨吸收。在本研究中，我们发现了高浓度的ASA Ⅵ(如1×10-3、1×10-4mol/L)对C2C12有明显的毒性作用，而低浓度的ASA Ⅵ对C2C12细胞增殖影响较小，但其却增强了C2C12的ALP活性，其中效果最佳的浓度是1×10-6mol/L。由于C2C12细胞生长速度较快，尽管我们降低了96孔板的细胞接种密度，但在4～5 d时，细胞仍旧铺满整个孔板，且有部分细胞出现了凋亡，所以我们选取了1、2、3 d这几个时间点来观察ASA Ⅵ对C2C12细胞增殖的影响。此外，ASA Ⅵ还上调了C2C12中Ocn、Runx2和Col1α1的mRNA和蛋白质水平。综上所述，我们得出结论，ASA Ⅵ通过诱导ALP、Ocn、Runx2和Col1α1等骨相关蛋白的表达来促进C2C12的成骨分化。

PCR结果显示，Ocn是其中明显增长的成骨指标之一。Ocn是成骨细胞分化和骨形成最重要的转录因子之一[25]。正常生理情况下，Ocn特异地与羟磷灰石结合，使骨盐沉积形成羟磷灰石结晶，调整骨矿化沉积速率，调节骨的生长，Ocn促进非结晶的钙磷盐向羟磷灰石转变，调整结晶在胶原上的分布、走向，进而增加骨盐含量提高骨强度，是成骨细胞的唯一特异性生化指标[26]。本实验结果显示1×10-6mol/L ASA Ⅵ作用7 d后，Ocn的表达增加，说明1×10-6mol/L ASA Ⅵ能促进C2C12细胞成骨分化。

目前已有学者证实ASA Ⅵ可以通过PI3K/AKT信号通路诱导骨髓基质细胞成骨分化[13]；还可以通过BMP-2/MAPK/SMAD依赖的Runx2信号通路诱导成骨细胞分化[27]。这些结果表明，一种药物可以通过多种信号通路协同作用。但是ASA Ⅵ到底是通过何种信号通路促进C2C12成骨分化还未知，仍需后续研究证实。

虽然关于C2C12的潜能和ASA Ⅵ对成骨细胞的作用分别有报道，但ASA Ⅵ对C2C12分化的影响却鲜有报道。本研究将ASA Ⅵ和C2C12结合起来，发现ASA Ⅵ的加入显著促进了C2C12的成骨分化，也为治疗骨质疏松症提供了一个新的视角。