反复种植失败患者种植期子宫内膜FST、Activin B表达水平*

李伟伟，刘 聪，闫娅妮，殷秀荣△，史凤颖，李丽玮

(河北省秦皇岛市妇幼保健院：1.生殖医学科；2.产科 066000)

目前，随着女性生育年龄的延迟和生育能力的降低，不孕症已经成为全社会关注的热点。辅助生殖技术(ART)近年来成为不孕不育患者有效的治疗方法。随着ART技术的优化，胚胎质量有了较大的提高和改善，但胚胎的着床率仍然不高，所以ART中胚胎的着床问题已成为提高妊娠率的限制性问题。胚胎植入成功与否不仅取决于胚胎发育成囊胚的潜能，更决定于内膜的容受性状态[1-2]。胚胎反复植入失败(RIF)降低了体外受精(IVF)的妊娠率，近年来成为辅助生殖领域的研究热点。胚胎RIF目前尚未有统一的定义，主要观点认为移植大于或等于3个周期，且均有优质胚胎移植，但是未获得妊娠[3]。内膜的容受性是指内膜对胚胎的接受能力，子宫内膜种植窗持续时间较短，种植窗期内膜对胚胎的接受能力决定移植成功的关键因素。

激活素(Activin)和卵泡抑素(FST)是细胞转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员，主要由垂体细胞和卵巢颗粒细胞分泌[4]。通过内分泌及自(旁)分泌调节作用参与了女性体内众多的生殖生理活动。FST和Activin存在于人的子宫内膜和输卵管上皮细胞，在月经周期中调节内膜的生理性改变[5]。FULLERTON等[6]学者认为，FST在小鼠子宫内膜的容受性和蜕膜化过程中发挥了重要的作用。 PRAKASH等[7]研究显示，与健康可育女性相比，RIF女性子宫内膜上皮腺细胞中FST的表达水平明显降低。FST通过与TGF-β超家族的共有β亚单位结合，从而拮抗其结合物的生物活性。CRUZ等[8]研究表明，子宫内膜的FST缺失，将会导致内膜对雌激素和孕酮的信号不应答，所以胚胎无法着床于内膜，不能妊娠。本研究旨在探讨Activin B、FST与RIF患者的关系及其影响机制，从而对IVF周期中发生RIF的风险做出预测，并为临床治疗提供更为科学的指导。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年5月至2019年12月在本院生殖医学科进行ART[IVF与胚胎移植(ET)或卵泡浆内单精子显微注射(ICSI)]治疗的不孕患者，其中由于男方因素或者输卵管因素于本院首次进行ART助孕后妊娠并分娩的患者作为对照组；至少进行3次移植(新鲜或者解冻的胚胎，每次至少有1枚优质胚胎，移植优质胚胎数大于或等于4)均未妊娠的患者作为RIF组；每组15例。 两组患者进入周期前评估，卵巢储备功能尚好，同意选择常规的方案进行控制性促排卵。纳入标准：(1)符合不孕症的诊断标准；(2)年龄23～37岁；(3)进行3次及以上取卵周期并每个周期有1个优质胚胎移植而未孕；(4)基础内分泌正常，且有正常月经周期；(5) 进入周期前6个月未进行过宫腔操作或使用激素类药物。排除标准：(1) 宫腔异常形态；(2) 染色体异常或其他遗传因素引起的RIF；(3)既往有卵巢功能不全 、卵巢早衰 、多囊卵巢综合征等影响卵巢反应性的疾病；(4)子宫内膜异位症患者；(5)可移植的优质胚胎(7个细胞以上，碎片小于10%的卵裂胚，或者4BB、5BB的囊胚)<2个；(6) 有传染性疾病；(7) 输卵管积水。本研究经秦皇岛市妇幼保健院伦理委员会讨论通过，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1内膜标本的采集

所有研究对象的内膜均在进入治疗周期前1个月经周期的第21～22天[体内促黄体生成素(LH)峰的第7天]或排卵后第6天行宫腔镜取内膜或者子宫内膜刺激时留取。将内膜一式两份，一份送病理科用于切片和免疫组织化学(IHC)检查，一份保存于液氮中用于FST、Activin B、骨形态蛋白4(BMP4)及Smad3的Western blot检测。并收集该日的空腹静脉血2 mL，离心取上清液，保存于-20 ℃待用。

1.2.2内膜组织总蛋白的提取

总蛋白提取试剂盒购自北京索莱宝有限公司，严格按照试剂盒操作说明进行提取蛋白。迅速从液氮中取出内膜组织放于冰上，融于室温下。用剪刀剪碎组织后，称取0.1～0.2 g组织，置于干净的离心管内，加入500 μL组织裂解液(已加入蛋白酶抑制剂),然后用组织匀浆器匀浆至无明显固状物质。吸取匀浆于预冷的尖底离心管内，4 ℃，10 000 r/min，离心5 min，吸取上清液于-80 ℃保存待用。

1.2.3采用Western blot检测内膜组织中FST、Activin B、BMP4和Smad3蛋白的表达

采用牛血清蛋白(BCA)法测定蛋白浓度，根据吸光度值从标准曲线中计算蛋白的浓度。根据蛋白浓度计算上样量。本研究实验的样品量为20 μL，上样量为30 μg。临用前加入最终的样品缓冲液:2%十二烷基硫酸钠(SDS)、100 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)、60 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris，pH 6.8)、0.01%溴酚蓝和10%甘油。在电极(正极)上依次叠放聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和凝胶。转膜结束，将膜浸入封闭液(含5%脱脂奶粉的Tris缓冲盐)中缓慢振荡后洗涤;加一抗(FST一抗购自invitrogen,批号AB_10982080；Activin B抗体ProSpec，批号：CYT-058;BMP4抗体购自abcam，批号：ab209851；Smad3抗体购自abcam，批号：ab40854)4 ℃缓慢振荡过夜；加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶10 000稀释)，室温缓慢振荡2 h后洗涤;以β-action作为内参，采用Quantity One软件将条带转化为灰度值，蛋白表达量=目的条带灰度值/内参条带灰度值。

1.2.4采用免疫发光法测定性激素和抗缪勒管激素(AMH)的水平

采用罗氏公司的Cobas601测定两组患者基础的内分泌水平，包括雌二醇(E2)、孕酮(P)、LH、卵泡刺激素(FSH)的水平及AMH的水平，每个结果测定3次，取平均值。

1.2.5观察指标及随访

参照欧洲辅助生殖会议，RIF定义：3次及以上优质胚胎移植未妊娠或移植大于 10 枚胚胎未妊娠[9]。胚胎质量评价标准参照 Brown′s 形态学评分系统评分[10]。优质胚胎定义:胚胎评级为Ⅰ级和Ⅱ级的胚胎。采用超声监测移植日内膜厚度。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 两组患者一般资料比较

两组患者年龄、不孕年限、体重指数(BMI)、不孕原因、不孕类型、受精方式比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组患者一般资料比较(n=15)

2.2 两组患者性激素及AMH水平的比较

两组患者基础内分泌水平和AMH的水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.3 两组患者控制性促排卵及移植日内膜厚度比较

扳机日比较两组患者的E2、P、获卵数、促性腺激素(Gn)用量、注射Gn时间等，两组差异均无统计学意义(P>0.05)；两组患者移植日内膜的厚度比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表2 两组患者基础内分泌水平及AMH水平比较

表3 两组患者控制性促排卵情况比较

2.4 两组患者内膜FST 和Actvin B表达水平比较

Western blot检测结果显示，RIF组FST蛋白的相对表达量明显低于对照组，RIF组Actvin B蛋白的相对表达量明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4、图1。

表4 两组患者FST、ActivinB蛋白相对表达量比较

图1 两组患者FST和Activin B蛋白表达

2.5 两组患者内膜BMP4和Smad3表达水平比较

Western blot检测结果显示，RIF组BMP4蛋白的相对表达量明显低于对照组，RIF组Smad3蛋白的相对表达量明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表5、图2。

表5 两组患者BMP4、Smad3蛋白相对表达量比较

图2 两组患者Smad3和 Bmp4蛋白的表达

3 讨 论

ART技术已经成为不孕患者的主要治疗手段，但仍然有些不孕女性存在RIF的情况，目前如何解决此问题成为辅助生殖领域研究的热点。高质量的胚胎和良好的内膜容受性是胚胎成功妊娠的关键因素。子宫内膜在植入期间和蜕膜期间会受许多因素的影响，这些因素可能对IVF成功妊娠的结局至关重要。REFAAT[11]提出Activin及其相关蛋白在调节子宫内膜容受性，滋养细胞活性和胚胎着床中起着重要作用。这些候选蛋白的病理表达与植入异常和早孕失败有关。有研究表明，在流产、反复流产、妊娠期高血压及IVF后RIF的妇女中，FST、Activin和抑制素的表达与调节存在异常[12-15]。本文主要研究子宫内膜容受性的相关蛋白的表达情况，在蛋白水平上研究子宫内膜容受性的调控，以改善内膜的容受性，提高ART的成功率及胚胎的利用率。

子宫内膜在雌孕激素的作用下，发生增殖、分泌，出现短暂的种植窗，一部分基质细胞分化为蜕膜细胞。有学者研究表明，Activin和FST在子宫内膜异位症患者的内膜中表达增加[16]，说明FST和Activin在子宫内膜的蜕膜化的调节中发挥了重要作用。有研究在2006年报道，Actvin A在子宫内膜在蜕膜化的细胞中高度表达[17]。本研究结果表明,RIF组患者FST蛋白表达明显低于对照组，说明FST的缺失可能是RIF的影响因素，但是具体机制还有待进一步研究。本研究进一步检测下游基因，RIF组的BMP4蛋白水平明显降低，而Smad3蛋白的表达量明显增高(P<0.05)。在临床工作中，可以用FST和Activin B在内膜上的表达情况预测RIF的情况，从而为患者节省胚胎、减轻其心理负担。

综上所述，RIF患者种植窗期，子宫内膜FST蛋白缺失，Actvin B蛋白增加，说明其在内膜容受性中均起到重要的调节作用，可能会导致胚胎不能成功着床。由于本研究的样本量不够多，可能存在一定的误差性，但是仍然希望本研究能够对ART中发生RIF的风险做出预测，并为临床治疗提供更为科学的指导。