血清UCH-L 1和GFAP水平对新生儿窒息后脑损伤的诊断价值*

魏超平，张芳萍，孙裕平

(山东省青岛市妇女儿童医院：1.NICU；2.神经内科 266000)

新生儿窒息由于脑组织严重受损可引发包括窒息后缺氧缺血性脑病(HIBD)在内的脑部疾病，临床表现为神经发育异常、中枢神经运动障碍、智力低下及视听障碍等[1-2]。相关文献显示，我国每年严重脑损伤新生儿超过60万，致残率高达27%以上，严重威胁新生儿健康及社会人口素质[3]。生物标志物检测作为一种与细胞生长及增殖相关的新兴检测技术受到越来越多的关注。神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)是中枢神经系统星形胶质细胞携带的细胞骨架蛋白，是星形胶质细胞特征性标志物。在新生儿窒息后HIBD中，神经元及神经胶质细胞均会受到不同程度损伤。泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)则是一类神经元细胞高特异性表达蛋白[4-5]。本研究旨在通过应用UCH-L1和GFAP水平评估新生儿窒息后HIBD的预后，为临床诊疗提供一定参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月至2019年1月本院收治的新生儿窒息后HIBD患儿120例。纳入标准：(1)符合《新生儿窒息诊断和分度标准建议(2013年版)》规定的HIBD相关诊断标准[6]；(2)胎龄34～39周，出生体重大于2 500 g。排除标准：(1)伴随感染性疾病、先天性心脏病、神经系统畸形；(2)低血糖脑病或胆红素脑病等其他原因造成的脑损伤。根据临床检查及颅脑超声结果将HIBD患儿分为轻度组(意识清醒，无脑细胞损伤，脑电图正常，n=61)、中度组(意识迟钝、肌张力低下，中度脑细胞损伤、脑水肿，部分有颅内出血，n=34)和重度组(生后即有浅昏迷或昏迷，呼吸暂停，肌张力松弛，皮层脑细胞严重损伤或坏死，伴有颅内出血，n=25)。其中，轻度组：男30例，女31例；胎龄35～39周，平均(38.22±5.35)周。中度组：男19例，女15例；胎龄34～39周，平均(38.31±5.44)周。重度组：男14例，女11例；胎龄34～39周，平均(38.16±5.74)周。另选取同期健康新生儿115例作为对照组，其中，男58例，女57例，胎龄35～39周，平均(38.78±6.44)周。4组新生儿性别、胎龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1标本采集及检测

采集4组新生儿出生后6 h、3 d外周静脉血3 mL，3 000 r/min离心15 min，收集上清液置于-70 ℃待测。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测UCH-L1、GFAP水平。(1)UCH-L1检测：试剂盒购自美国SANTA CRUZ公司，检测仪器采用美国Bio-Rad公司生产的Bio-Rad 680酶标仪。将待测样品用稀释液C稀释至合适浓度，将不同浓度标准品及待测血清样品取100 μL加入孔板，室温孵育2.5 h；每孔加入洗涤液300 μL充分洗涤后吸去液体，每孔继续加入备用生物素标记的抗UCH-L1抗体100 μL，室温孵育1 h，充分洗涤后依次加入Item G、Item H，最后加入终止液；尽快将孔板置于酶标仪，波长选择450 nm，检测各孔吸光度值，UCH-L1测定范围为0.50～180.00 ng/mL，正常参考值为0.70～1.10 ng/mL。(2)GFAP检测：试剂盒及检测仪器同上。使用检测缓冲液将待测样品稀释，将稀释样品取100 μL加入孔板，同时设置一系列标准品孔，室温下孵育2 h，洗涤液充分洗涤后，每孔依次加入抗GFAP抗体、酶溶液、四甲基联苯胺(TMB)溶液及终止液，待溶液由蓝变黄后置于酶标仪下检测，测试波长450 nm，GFAP测定范围为0.03～50.00 ng/mL。正常参考值为0.10～1.20 ng/mL

1.2.2观察指标

(1)比较有、无HIBD后遗症患儿出生后6 h、3 d的血清UCH-L1、GFAP水平；(2)采用受试者工作特征(ROC)曲线评估血清UCH-L1、GFAP对新生儿窒息后HIBD早期预测价值；(3)新生儿出生后6 h、3 d的血清UCH-L1、GFAP与Gesell发育量表(GDS)评分相关性分析。

1.2.3随访

HIBD患儿给予相应治疗，好转出院后进行为期12个月的随访，随访内容包括神经系统表现、视力听力检查、生长发育指标等，评估其是否出现后遗症。随访12个月后，采用GDS对患儿神经功能检查进行评估[7]，发育商小于或等于75分提示患儿出现智力残疾，或癫痫发作，可视为发生后遗症。根据是否发生后遗症将HIBD患儿分为无后遗症组和有后遗症组。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 4组新生儿不同时间UCH-L1、GFAP水平比较

出生后6 h、3 d，4组新生儿血清UCH-L1、GFAP水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中，HIBD重度组血清UCH-L1、GFAP水平在出生后6 h、3 d均最高，对照组水平最低，各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；轻度组、中度组、重度组在生后3 d血清UCH-L1水平明显低于生后6 h，而血清GFAP水平明显高于生后6 h(P<0.05)，见表1。

表1 4组新生儿出生后6 h、3 d的UCH-L1和GFAP水平比较

2.2 有、无后遗症患儿UCH-L1、GFAP水平比较

随访12个月，120例HIBD患儿中无后遗症86例(无后遗症组，71.67%)，GDS评分为(80.62±7.71)分；有后遗症34例(有后遗症组，28.33%)，GDS评分为(73.45±7.38)分，两组患儿GDS评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。有后遗症组血清UCH-L1、GFAP水平在出生后6 h、3 d均明显高于无后遗症组(P<0.05)，见表2。

表2 有、无后遗症患儿UCH-L 1、GFAP水平比较

2.3 血清UCH-L1、GFAP对HIBD早期预测价值

出生后6 h血清UCH-L1预测新生儿窒息后HIBD的灵敏度为85.34%，特异度为88.93%，曲线下面积(AUC)为0.916(95%CI：0.870～0.962，P=0.028)；出生后6 h血清GFAP预测新生儿窒息后HIBD的灵敏度为81.27%，特异度为83.61%，AUC为0.872(95%CI：0.714～0.896，P=0.013)，见图1。

图1 血清UCH-L 1、GFAP预测新生儿窒息后 HIBD ROC曲线

2.4 血清UCH-L 1、GFAP水平与GDS评分相关性分析

相关性分析结果显示，出生后6 h新生儿血清UCH-L1、GFAP水平与GDS评分呈负相关(r=-0.576，P=0.001；r=-0.739，P=0.014)；出生后3 d血清UCH-L1、GFAP水平与GDS评分呈负相关(r=-0.626，P<0.001；r=-0.457，P=0.003)。

3 讨 论

HIBD是导致围生期新生儿脑损伤的常见疾病，目前HIBD造成的脑损伤主要依赖病史、体格检查，结合磁共振成像(MRI)或头颅CT等检查确定[8]。不同的检测方法有着不同的限制性，如体格检查存在偏高的假阴性率；MRI或CT不仅价格昂贵，还需要患儿保持一定时间的镇静状态，并使得患儿接受多次电离辐射存在二次脑损伤的可能，且影像学改变无法准确预测脑功能改变，部分神经影像学检测正常而患儿临床症状却较为严重[9]。因此，寻找合适的HIBD脑损伤生物标志物以期更早地发现新生儿脑损伤具有十分重要的意义。

UCH-L1是一种高度特异性表达在神经元细胞的蛋白，其在血液中的水平升高通常与脑神经细胞损伤或血脑屏障破坏有关。UCH-L1升高已被普遍认为是包括早期重型颅脑损伤及急性脑缺血性疾病在内的中枢神经系统损伤的标志物[10]。黄玮玲等[11]将130例早产儿分为脑白质损伤组、脑室周围-脑室内出血组及无脑损伤组，比较各组血清UCH-L1水平发现，脑白质损伤组、脑室周围-脑室内出血组血清UCH-L1水平均明显高于无脑损伤组。WELCH等[12]对251例轻度创伤性脑损伤患者进行研究分析，发现相较于S100B蛋白，血清UCH-L1识别正常、异常CT表现的灵敏度、特异度均更优。GFAP是一种特异性酸性蛋白，多存在于中枢神经系统星形胶质细胞内，被认为是该细胞的特有标志物，在维持细胞形态及功能上均有重要作用，当中枢神经受损后，星形胶质细胞活化增生，GFAP迅速合成，体内水平随之升高[13]。陈长春等[14]研究发现，足月新生儿HIBD发病后不同时间、不同严重程度脑脊液GFAP水平均存在差异。不过脑脊液需腰椎穿刺获取，相关报道并不多。但动物模型显示，脑损伤小鼠脑组织的UCH-L1及GFAP表达较对照组明显升高[15]。

基于以往研究基础，为了进一步探究血清UCH-L1和GFAP水平对新生儿窒息后HIBD的影响及早期预测价值，本研究将120例HIBD患儿分为轻度组、中度组及重度组，并与同期健康新生儿作比较，结果显示，出生后6 h、3 d，对照组、轻度组、中度组、重度组血清UCH-L1、GFAP水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中，HIBD重度组血清UCH-L1、GFAP水平在出生后6 h、3 d均最高，对照组水平最低；轻度组、中度组、重度组血清UCH-L1水平在出生后3 d明显较出生后6 h降低(P<0.05)，血清GFAP水平较出生后6 h明显升高(P<0.05)。提示脑损伤早期神经元受到一定影响，星形胶质细胞参与了HIBD病理、生理早期修复，血清UCH-L1在出生3 d后较出生6 h时降低，可能是由于出生后患儿脑神经元细胞破坏逐渐缓解，释放的血清UCH-L1开始减少[16]；而GFAP在出生3 d后较出生后6 h时升高，可能是由于星形胶质细胞后期仍处于活化状态起着修复作用。经过为期12个月的随访，有后遗症组患儿血清UCH-L1、GFAP水平在出生后6 h、3 d均明显高于无后遗症组。提示血清UCH-L1、GFAP与HIBD患儿预后有一定关系。出生后6 h血清UCH-L1、GFAP预测新生儿HIBD的灵敏度分别为85.34%、81.27%，特异度分别为88.93%、83.61%，AUC分别为0.916、0.872；出生后6 h、3 d新生儿血清UCH-L1、GFAP水平与GDS评分均呈负相关(P<0.05)。

综上所述，血清UCH-L1、GFAP在HIBD患儿出生后6 h即明显升高，其水平与患儿脑损伤严重程度及预后有一定关系，对HIBD新生儿进行UCH-L1、GFAP检测有助于作出早期脑损伤判断，可为临床后续治疗提供参考依据。