应用iTRAQ技术联合PRM验证技术筛选肝硬化患者急性肾损伤的早期预测生物标志物

王来亮，周芳芳，黄璐璐，罗群

急性肾损伤（AKI）是肝硬化患者常见并发症，发病率可高达20%[1]。肝硬化并发AKI患者住院时间长，多器官衰竭的风险高，30 d的病死率是未并发AKI患者的10倍[2]。肝硬化并发AKI至今尚无特效治疗，早期预测并干预是改善该类患者预后的重要措施。肾功能评估的主要指标血肌酐（Scr）受影响因素多，依赖Scr诊断AKI既不敏感也不特异。定量蛋白质组学的迅速发展对发现AKI新型标志物和研究其发病机制有着重要意义。同位素标记相对和绝对定量技术（iTRAQ）是一种定量蛋白质组学的经典方法，具有定量较准确，全面分析中低丰度蛋白等优点，弥补了其他如基于双向电泳难以检测出低丰度、小分子量蛋白的不足。平行反应监测（PRM）是目前新型的靶向蛋白验证手段，具有高分辨、抗干扰，重现性好，成本更低的特点，谱图可直接检索数据库，与iTRAQ蛋白质组学技术联合可同时完成生物标志物的发现和验证。本研究应用iTRAQ技术筛选肝硬化并发AKI的早期差异表达蛋白，并通过PRM技术对靶向蛋白进行验证，从而筛选出肝硬化并发AKI的早期预测新型生物标志物，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2018年1月至2019年12月在中国科学院大学宁波华美医院住院的肝硬化患者90例，均符合年龄≥18岁，入院时未确诊为AKI，但存在AKI高危因素，且取得患者知情同意。排除器质性肾脏病者，已接受透析治疗者，拟行或已行肝肾移植者，伴有肿瘤者，确认怀孕，预期寿命不足3 d者，无法对患者或法定代理人进行知情告知者。根据是否并发AKI将患者分为AKI组（肝硬化并发AKI）和对照组（肝硬化未发生AKI）。

1.2 方法

1.2.1 收集临床资料包括患者年龄、性别、体质量指数（BMI），合并症（高血压、糖尿病等），AKI高危因素情况（大量放腹水、消化道出血、感染/自发性腹膜炎、大量使用利尿剂及静脉使用对比剂等[3]），入院出现AKI高危因素后第1、2天Scr水平。

1.2.2 iTRAQ技术筛选差异蛋白留取出现AKI高危因素后第1天尿液10ml，置于―80℃冰箱保存待检。样本预处理，提取总蛋白溶液，分装后用iTRAQ分析，参考Bradford法进行蛋白浓度测定，蛋白还原烷基化及酶解处理成多肽，同位素标记肽段，应用LC-MS/MS技术，反相色谱分离及反向色谱-TripleTOF分析，结合数据库检索，获得差异蛋白的鉴定列表和定量信息。差异蛋白筛选标准为浓度升高至对照组的1.5倍以上。

1.2.3 PRM验证靶蛋白从上述iTRAQ筛选的差异蛋白中选择丰度较高的靶蛋白，制备样本的肽段混合物，根据靶蛋白的丰度情况，事先对样本进行富集；根据挑选的靶肽段信息，进行预实验，调整流出时间，或者重新挑选靶肽段；对正式样本进行PRM检测及数据分析。

1.3 统计方法采用Stata 12.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，不同时间段比较采用方差分析，两组比较采用t检验；计数资料比较采用2检验或Fisher确切检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况11例（12.2%）患者在住院期间发生AKI，包括自发性腹膜炎5例，上消化道出血3例，大量放腹水1例，大量使用利尿剂1例，静脉使用对比剂1例。AKI组男4例，女7例；年龄（62.1±14.7）岁；BMI（22±3.60）kg/m2；合并症高血压2例，糖尿病4例。对照组男44例，女35例；年龄（61.6±14.6）岁；BMI（23.54±4.09）kg/m2；合并症高血压17例，糖尿病20例。两组上述差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

两组在高危因素出现前和出现后第1天Scr水平差异均无统计学意义（均P＞0.05），高危因素出现后第2天时差异有统计学意义（t=8.78，P＜0.05）。AKI组在高危因素后出现第2天Scr水平较出现前明显升高（P＜0.05），见表1。

表1 两组高危因素出现前、出现后第1天及第2天Scr水平比较 mol/L

2.2 差异蛋白筛选及验证AKI组与对照组在高危因素出现后第1天尿液中共筛选出289个差异蛋白，其中上调蛋白64个，下调蛋白225个。在上调的差异蛋白中，AKI组谷氧还蛋白-1（GRX1）与S100钙结合蛋白A7（S100A7）在高危因素出现后第1天分别升高至对照组的1.76倍及1.51倍。PRM技术验证结果显示，AKI组GRX1与S100A7水平分别升高至对照组的2.51及2.17倍，与iTRAQ技术筛选时的浓度变化趋势一致。

3 讨论

GRXs属于硫氧还蛋白（TRX）家族，在细胞对氧化应激反应中发挥重要作用[4]。GRX1主要位于肾远曲小管细胞顶部。Godoy等[5]发现，在缺血再灌注小鼠模型中，GRX1在小鼠尿液中特异性分泌增加。GRXs既可作为氧自由基的清道夫，也可作为抗凋亡分子和转录因子的氧化还原调节因子。抑制GRX1表达水平证明可以抑制凋亡信号调节激酶1的激酶活性。细胞实验发现，缺血再灌注处理的细胞中若GRX1蛋白表达增加，细胞存活率和增殖率均高，且氧化损伤程度较轻[5]。

S100A7、S100A8和S100A9是S100钙结合蛋白的成员，主要来源于中性粒细胞，也可由单核细胞、活化的巨噬细胞、树突状细胞和黏膜鳞状上皮产生。S100钙结合蛋白是先天免疫系统的激活因子。Tan等[6]发现，S100钙结合蛋白通过激活TLR4/NLRP3炎症小体途径参与对比剂AKI的发生。Dessing等[7]发现S100钙结合蛋白在缺血再灌注后巨噬细胞介导的肾脏修复中起关键作用。Kim等[8]发现，S100钙结合蛋白水平在肾前性AKI中不升高，而在肾实质性AKI中升高。S100钙结合蛋白水平升高可能提示发生肾实质性AKI时免疫反应和炎症活动激活[8]。另有研究发现，S100A7表达水平升高与肾损伤程度平行[6]。因此，S100A7不仅是一种炎症标志物，而且在炎症性疾病的发病机制中发挥着关键作用。本研究发现，iTRAQ技术联合PRM验证技术筛选出的蛋白GRX1与S100A7在肝硬化并发AKI患者尿液中明显升高，且早于Scr变化，可作为肝硬化患者并发AKI的早期预测新型生物标志物。

综上所述，尿蛋白GRX1与S100A7在肝硬化患者AKI高危因素出现后Scr未明显变化时已升高，可能是肝硬化并发AKI的早期预测新型生物标志物。但本研究样本量相对较小，且筛选出的标志物未在新的肝硬化人群中进一步验证，有待将来在大样本中进一步验证。