蛋白质免疫印迹技术在大学生创新实验中的应用

陈立杰　杜巧丽　陈美晴　谢鑫

摘 要 在生物功能研究过程中，通常需要从混合蛋白中区分、检测目标靶蛋白，而蛋白免疫印迹技术能较好的实现该目的。蛋白免疲印迹技术是一种先择性地结合被分离混合物中特异蛋白的分析技术，具有灵敏度高、特异性强、分辨率高、分析容量大，可对蛋白进行定性、定量分析，检测蛋白的时空表达变化情况，被广泛应用于蛋白定性实验技术中。为在大学生创新实验中推广该技术，本教学实验以贵州大学本科生为对象，课程的主要内容包括了解蛋白印迹法的原理、目标蛋白载体的构建、蛋白可溶性表达、PAGE胶制作，以及蛋白质免疫印迹试验。该教学可提高学生对蛋白免疫印迹技术原理和实验操作技能的认识和掌握，同时训练学生在科研中的能力。

关键词 蛋白 免疫印迹 实验教学

中图分类号：G642                                   文献标识码：A    DOI：10.16400/j.cnki.kjdks.2021.01.022

Abstract In the process of biological function research， it is usually necessary to distinguish and detect the target protein from the mixed protein， and Western blot technology can better achieve this purpose. Protein immunoblotting is a kind of analytical technology that selectively combines the specific proteins in the separated mixture. It has high sensitivity， specificity， high resolution and large analysis capacity. It can be used for qualitative and quantitative analysis of proteins and detect the changes of spatiotemporal expression of proteins. It is widely used in the qualitative experiment of proteins. In order to popularize the technology in the innovative experiment of college students， this teaching experiment is aimed at undergraduates of Guizhou University. The main contents of the course include understanding the principle of western blotting， the construction of target protein vector， the soluble expression of protein， the preparation of page gel， and the protein immunoblot test. This teaching can improve students' understanding and mastery of Western blotting technology principle and experimental operation skills， and train students' ability in scientific research.

Keywords protein; immunoblotting; experimental teaching

蛋白質印迹法（蛋白免疫印迹）即Western Blot，[1-2]是在DNA印迹法（Southern blot）和RNA印迹法（Northern blot）之后，整合电泳、转印和免疫标记为一体的蛋白分离检测技术，是对电泳技术的进一步延深和发展。目前是一种应用比较广泛的蛋白质检测实验方法，主要应用于免疫遗传学、生物化学和分子生物学中，同时也广泛应用于蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个领域。[3]其基本原理主要是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的细胞或组织蛋白，用电印免疫印迹法转移到固相支持物（化学惰性的高分子转移膜，如聚偏二氟乙烯膜）上，然后将目标蛋白的特异性抗体（一抗）与转移膜上的目标蛋白进行免疫结合反应，再用被辣根过氧化物酶标记过的二抗与一抗结合，随后通过分析着色的位置和着色深度来检测目标蛋白。

进行蛋白质免疫检测通常需经过蛋白裂解及变性、蛋白电泳分离、转模、封闭、一抗孵育、二抗孵育和特异性检测等环节，由于该试验涉及的步骤较多，对实验设备及操作人员的要求较高，目前还未针对本科生开设此类课程。本文以贵州大学面向本科生开设的大学生开放性实验课为基础，对该实验在本科实验教学中进行应用，教学效果良好。

1 课程内容设计

该课程为大学生创新性实验计划课程，是农业及生命科学学科的选修课程。整个实验课程内容为一个小设计型实验项目。本课程的主要内容包括掌握蛋白质印迹法的原理、目标蛋白载体的构建、蛋白质可溶性表达、PAGE胶制作，以及Western blot实验。

本课程通过设定不同条件（如温度、菌株及不同IPTG，异丙基硫代半乳糖苷，Isopropyl-D-Thiogalactoside，浓度），以实现对目标蛋白的可溶性表达。由于本课程需进行连续性实验，课程均安排于周末进行，共分为5次实验及1次汇报，每次实验时间约2～8学时，共约20～28学时。具体课程内容和安排见表1。

2 代表性结果

以在实验教学过程中1组同学选择的高粱（Sorghum bicolor）的抗病蛋白STG1为例。同学们对STG1进行了基因扩增、生物信息学分析、载体pET28a载体构建、原核表达条件摸索以及Western blot检测，最终用Anti His抗体在重组菌株的上清样品中检测到一条清晰单一条带，而空载体对照都没有相应条带，说明STG1蛋白成功表达。

3 教学效果

3.1 增强学生对蛋白免疫印迹技术及相关生化实验技术的理解

在本次大学生创新实验教学中，首先让学生利用在线网站和文献检索了解相关实验技术，了解其原理和实验操作步骤。其次，学生要通过自主设计实验并验证蛋白是否成功表达，前提就要求学生要对基因、蛋白有一定的了解。学生通过亲自参与整个实验设计与操作，更进一步地增强了对蛋白免疫印迹技术及相关生化实验技术的理解和掌握。

3.2 锻炼学生的动手和分析能力

在实验操作中，蛋白免疫印迹技术有两大关键因素：（1）必须将分离的蛋白很好地从PAGE凝胶上转到固相支持物上。在此过程中，对转膜缓冲液的选择显得尤为重要，它对蛋白与膜和探针的结合起着决定性作用。（2）对抗体的选择，抗体是目前在该技术中最常用的标记探针。在实验验证环节，许多学生会出现没有得到理想的预期结果（信号弱或无信号、条带大小与预期不符、非特异条带、背景高、污点等常见问题），这是可能由于在转膜过程中所配缓冲液组分不对，抗体选择不对（一抗、二抗选择及浓度选择），在转膜时温度过高，制作PAGE凝胶时胶上有气泡、胶厚度不一致、凝固程度不一致等因素造成的。这些都需要学生在操作过程中认真思考、按要求操作、多次摸索、总结经验、找出失败原因，多与老师和同学进行讨论问题才能最终找到解决方案。问题能得到有效的解决，是鼓励学生进行下一步实验的关键。对于在本实验中出现的问题，说明学生的动手操作能力还不够，在本科阶段很有必要设立此类动手能力强的生化实验类创新课程，提高本科生的实际动手操作能力。

3.3 实验教学的推广性分析

蛋白免疫印迹技术在分子生物学、生物化学和免疫遗传学中是一种非常实用的实验技术。对于只了解其理论知识而未受到过实际操作培训的同学，具有实际的意义。对于农业及生命科学学科类专业的同学，学校具备实施此类实验技术的相关设备，更应开设其相关实验课程。此外，该实验的最大优势就在于其适应性好，不需要特殊的实验仪器。因此，希望通过蛋白免疫印迹技术的推广，能让广大本科生受益。

4 教学总结

对2019年度的教学总结发现，40%的实验组通过自主学习下完成实验，约55%的实验组能在老师的指導下完成实验，5%的实验组不能顺利完成实验。教学实践结果显示该实验适合于高年级本科生（大三、大四），最好有分子生物学以及基本的生物信息学基础的同学。学生在课程结束时要PPT汇报，并写一份实验报告以及个人学习总结，以锻炼他们的书面和口头表达能力。从汇报和实验报告来看，学生对实验背景、材料与方法、实验操作过程和各阶段的实验结果都有清晰的认识。因此，非常有必要在本科教学中推广此类课程。

*通讯作者：谢鑫

参考文献

[1] Xu J， Bai L， Gu YY， Du F， Liu YJ. Synthesis， characterization， apoptosis， ROS， autophagy and western blotting studies of cyclometalated iridium（iii） complexes[J]. Inorganic Chemistry Communications，2019，111：107594.

[2] Moritz CP. 40 years Western blotting： A scientific birthday toast[J]. Journal of Proteomics， 2020，212.

[3] 宋亮，陈丹丹.浅谈蛋白质印迹法操作过程中的实验技巧[J].科技资讯，2015，13（21）：63-65.