豁痰解毒通络饮对大鼠颈总动脉球囊损伤后血管内膜增生的影响及作用机制研究

田腾辉，邓 悦，常立萍，石 锐，于克英，张 淼，邵 笑

（1.长春中医药大学，长春 130117；2.长春中医药大学附属医院，长春 130021）

动脉粥样硬化（AS）是冠状动脉性心脏病（coronary heart disease，CHD）关键的病理基础。近年来，内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）及其诱导的自噬（autophagy）被证实是多种疾病发生发展中共有的机制[1-3]。研究[4]表明，适度ERS 引起的自噬可协同减轻内质网负荷，抑制ERS 过度激活，具有抗AS作用，而持续的ERS 可过度激活自噬，导致EC 功能紊乱及炎症的产生，加速血栓形成[5]。本研究通过建立大鼠颈总动脉球囊损伤模型，探讨豁痰解毒通络饮抑制PCI 术后再狭窄的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性SPF 级SD 大鼠40 只，体质量（380±20）g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司[许可证号：SCXK（辽）2015-0001]。环境为昼夜节律，室温条件（27±2）℃，湿度条件（37±5）%。

1.2 实验药物 中药复方豁痰解毒通络饮（全瓜蒌20 g，当归15 g，丹参15 g，红景天15 g，金银花30 g等），购自长春中医药大学附属医院新绿色颗粒药房；阿托伐他汀钙片（20 mg），购自辉瑞制药有限公司（国药准字H20051408）。

1.3 主要实验试剂与仪器 实验试剂：RIPA 裂解液，碧云天生物技术公司；Trizol，Thermo Fisher Scientific；免疫组化超敏试剂盒（KIT-9710），福州迈新生物技术开发公司；兔源一抗，均购于CST 公司；辣根过氧化物酶二抗（羊抗兔，SA00001），购于Proteintech公司；总RNA提取试剂盒（9767）、DNA转录试剂盒（RR047A）均购自Takara 公司。实验仪器：2F Fogarty 冠状动脉扩张球囊，美国Edwards Lifescience 公司；Mini Protean 蛋白电泳仪（PowerPacTMHC）；实时荧光定量PCR 仪（CFX connect），美国伯乐公司；智能成像系统（iBright FL1000）。

1.4 动物分组及模型建立

1.4.1 分组 40 只SD 雄性大鼠随机分为假手术组、球囊损伤组、豁痰解毒通络饮组、阿托伐他汀组，每组10 只。治疗组分别予豁痰解毒通络方（6.67 g·kg-1·d-1）、阿托伐他汀（1.19 mg·kg-1·d-1）灌胃，其余组均以等体积生理盐水灌胃。术前12 h 禁食不禁水，均皮下注射低分子肝素钠。

1.4.2 球囊损伤模型 1%戊巴比妥钠40 mg·kg-1腹腔注射，麻醉满意后将大鼠固定于动物台，备皮、消毒后沿颈部正中切开皮肤，依次钝性分离至左侧颈总动脉，使用微型血管夹夹闭颈内动脉和颈总动脉近心端，4.0 缝合线结扎颈外动脉远心端，眼科显微剪于颈外动脉近心端附近45°剪“V”形开口，插入球囊导管，向近心端缓慢送入球囊约3 cm，以3.0～5.2 atm 压力扩张球囊并旋转退至切口，反复3 次以达到剥脱内膜的目的。术后结扎切口近心端，松开微型血管夹，观察血流恢复及出血情况，依次缝合切口。假手术组仅分离颈动脉。

1.5 苏木素-伊红染色 取损伤段颈总动脉约2～3 cm，浸入4%多聚甲醛溶液固定，经透明、脱水、包埋、切片、HE 染色等病理学操作，光微镜下观察并拍照。使用Image J 软件计算内膜面积（area of intima,IA）和中膜面积（area of membrane,MA），并计算比值。

1.6 免疫组织化学法检测GRP78 表达情况 按照免疫组化试剂盒（迈新9710）进行染色。将石蜡包埋切片脱蜡及水化后，经微波抗原修复、灭活、封闭、显色、复染等步骤后，将切片置于光镜（×100）下观察。以胞核出现棕黄色颗粒为阳性表达。

1.7 蛋白质免疫印迹试验检测大鼠颈总动脉中 IRE1α、XBP1、ATG5 蛋白表达水平 将损伤动脉段液氮研磨后加入RIPA 裂解液充分裂解，4 ℃，12 000 r/min离心15 min 取上清，使用超敏BCA 试剂盒测定并调平各组总蛋白浓度。上样量为每槽60 μg，配制10%或12%分离胶，浓缩胶为5%。电泳参数：一阶段为70 V，30 min，二阶段为140 V，50 min；甲醇预先5 min 活化PVDF 膜，15 V，300 mA，1 h 转膜，5%的脱脂奶粉室温封闭2 h，4℃一抗（1:2 000）摇床过夜，后经二抗（1:2 000）孵育1～2 h；超敏ECL 试剂盒显色，成像仪拍照后存储为TIF 格式。使用Image J 软件带进行灰度值分析，目的蛋白均以GAPDH 为内参。

1.8 实时荧光定量PCR 检测大鼠颈总动脉组织中XBP1、ATG5 mRNA 的表达情况 损伤段颈总动脉液氮研磨后，按照TAKARA（9767）试剂盒步骤提取Total RNA，鉴定其纯度及浓度，合格后反转录为cDNA（37℃，15 min；85℃，5 s，4℃）。采用25 μL反应体系进行qPCR 反应，条件为95℃，30 s，95℃，5 s，60℃，30 s，40 个循环。将目的基因CT 值按2-△△CT法进行表达量计算。引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR 引物

1.9 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行数据分析，所得结果采用均数±标准差（）表示，单因素方差分析进行组间比较，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 豁痰解毒通络饮对大鼠球囊损伤血管重构的影响 HE染色结果显示，假手术组内皮形态完整且光滑，排列均匀规律，由一层扁平血管内皮构成；球囊损伤组内膜细胞较为致密且排列紊乱，新生内膜导致壁层显著增厚，I/M 显著高于假手术组（P＜0.01）；与球囊损伤组比较，各治疗组新生内膜厚度均明显降低，管腔狭窄程度显著减轻，I/M 比值小于球囊损伤组但大于对照组（P＜0.05）。见图1，表 2。

图1 各组大鼠颈总动脉病理变化（HE，×100)

表2 各组大鼠颈总动脉内膜增生情况（，n =10）

表2 各组大鼠颈总动脉内膜增生情况（，n =10）

注：与假手术组比较，## P ＜0.01；与球囊损伤组比较，△P ＜0.05

2.2 豁痰解毒通络饮对大鼠增生内膜中GRP78 蛋白表达水平的影响 GRP78 在胞核中几乎不被染色而呈蓝色颗粒，但其活化后进入细胞核，可出现棕黄颗粒的核染色，故胞核呈现棕黄色颗粒则说明GRP78 阳性表达。结果显示，与假手术组相比，球囊损伤组新生内膜中出现大量棕黄色颗粒，呈现出过表达；与球囊损伤组相比，豁痰解毒通络饮组和阿托伐他汀组新生内膜中胞核多为蓝色，仅见少量棕黄色颗粒。见图2。

图2 各组大鼠增生内膜GRP78 蛋白的表达水平（IHC，×100）

2.3 豁痰解毒通络饮对大鼠增生内膜中IRE1α、XBP1、ATG5蛋白表达水平的影响 与假手术组比较，球囊损伤组IRE1α、XBP1 和ATG5 蛋白表达量显著升高（P＜0.01）；与球囊损伤组比较，豁痰解毒通络饮组和阿托伐他汀组IRE1α、XBP1 和ATG5 蛋白表达量显著降低（P＜0.05）。见图3。

图3 豁痰解毒通络饮对大鼠增生内膜中IRE1α、XBP1 和ATG5 蛋白表达的影响（，n=10）

2.4 豁痰解毒通络饮对XBP1、ATG5 mRNA 表达水平的影响 与假手术组比较，球囊损伤组XBP1、ATG5 mRNA 的表达量显著升高（P＜0.01）；与球囊损伤组比较，各给药组明显降低XBP1、ATG5 mRNA 的表达水平（P＜0.01）。见图4。

图4 豁痰解毒通络饮对XBP1、ATG5 mRNA 表达水平的影响（，n=10）

3 讨论

内质网（ER）是细胞内蛋白质合成、折叠以及修饰的重要细胞器，也是脂质合成和钙存储的重要场所。应激环境下，ER 功能失调可触发内质网应力，进而激活未折叠蛋白质反应（UPR）以期恢复ER 的稳态。UPR 的激活存在3 条信号转导途径：肌醇需求酶-1（IRE1）、淀粉内质网激酶（PERK）及活化转录因子6（ATF6）途径[6]，这些途径可根据ERS 的强度、持续时间以及细胞类型促进细胞适应性存活或凋亡[7]。研究发现，适度的自噬是细胞应对UPR 的一种自我保护机制，通过对ER 中堆积的蛋白进行降解以减轻ERS[8]。GRP78 是UPR 应答的主体，作为分子伴侣可介导新生蛋白质的正确折叠和装配。GRP78 正常以非活性形式与ATF6、PERK 和IRE1 结合，作为UPR 跨膜应力传感器，ERS 发生时，GRP78 被激活并解离，启动UPR 调节的相关降解程序[9]。IRE1α-XBP1通路是ERS 与自噬相关联的重要调控通路。IRE1α 与GRP 78 以非活性状态结合，当IRE1α 激活后具有了核酸内切酶活性，可破坏mRNA 内含子的24 个碱基片段，并编码X-box 结合蛋白1（XBP1），加强对堆积蛋白的降解，但XBP1 的过度表达会损害细胞，促进AS 的形成[10]。有研究表明，IRE1α-XBP1 可通过增强Beclin-1 的转录水平正向调控自噬[11]，当ERS 负荷超载时，ATF4 可诱导自噬启动因子Beclin-1、ATG5、ATG12 等信号的激活，影响着AS 的进展[12]。

随着PCI 治疗的普遍开展，中医学者不断融合了现代医学理论，丰富和发展了PCI 术后再狭窄的病因病机学说。最新诊疗指南[13]指出，本病虚证以脏腑气血阴阳亏虚为主，标实以血瘀、痰阻、气滞、寒凝多见，并将复合证型分为气虚血瘀证、痰瘀互阻证和热毒血瘀证。

豁痰解毒通络饮是邓悦根据多年的中医临床实践凝练出的中药方剂，其选药考究、药味精练、配伍得当，在临床及科学研究中均证实有良好疗效[14-15]。邓悦[16]认为，PCI术后再狭窄的病机为“痰瘀伏络、蕴结成毒”。隐而不发是伏邪从侵入人体到疾病发作之前的状态特征，此时PCI 治疗的血管内膜段在原有AS 的基础上继发炎性反应、血栓形成及内膜增殖、迁移等病理变化，使管腔逐渐狭窄；邪伏日久，多易暗耗正气、损伤脏腑，又或伏邪热化，加深毒性。鉴于本病的病机特点，我们以“豁痰解毒通络”为治法，采用豁痰解毒通络饮作为本研究的方剂，通过实验研究探索其内在生物学机理。研究结果显示，豁痰解毒通络饮明显抑制内膜增生，减轻管腔狭窄；并且下调大鼠颈总动脉损伤组织中内质网应激信号GRP78-XBP1-IRE1α的表达量，且降低自噬信号通路中ATG5 的表达量。我们推测，豁痰解毒通络饮可能通过抑制大鼠颈总动脉损伤组织中内质网应激-自噬的过度激活来抑制内膜增生，从而达到治疗再狭窄的目的。

越来越多的证据表明自噬发生在晚期AS斑块中，是对抗ERS 的适应性反应。降低ERS 通路过表达，可减轻自噬的过度激活，从而延缓AS 的发生。本次实验探究了豁痰解毒通络饮的药理作用机制，为其防治冠脉再狭窄提供了科学依据，但冠脉再狭窄发病机制复杂，在今后的研究中仍需多途径、多维度地进行深入挖掘。