表儿茶素对大鼠缺血再灌注后神经元凋亡及Caspase⁃3、Bcl⁃2、Bax 蛋白的影响

黄凡 李德丽 蒋嫦月 胡婉湘 谢露

缺血性脑血管病是临床多见的脑血管疾病，临床上首选恢复血氧供应，在恢复血流的同时将进一步加重损伤，称之为脑缺血再灌注损伤（Cere⁃bral ischemia reperfusion injury，CIRI）。神经元凋亡是CIRI 的主要环节，抗凋亡治疗可能成为脑缺血治疗的主要内容。表儿茶素（Epicatechin，EC）主要存在于可可、绿茶中，易透过血脑屏障，其抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理活性已作广泛研究，也有研究表明EC 可抑制牛磺酸脱氧胆酸诱导的Huh7 细胞促凋亡蛋白Bax 表达，细胞色素C 释放及p38 蛋白激酶磷酸化从而抑制线粒体损伤导致的细胞凋亡［1］，这表明EC 在抗神经元凋亡上具有潜在的价值。本研究通过观察EC 对大鼠CIRI 后缺血侧脑皮质区神经元凋亡及Caspase⁃3、Bcl⁃2、Bax 蛋白的影响，旨在为临床治疗缺血性脑血管病提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料 （1）实验动物54 只雄性SD 大鼠，体质量200-240 g，购自广西医科大学实验动物中心，动物许可证号SCXK（桂）2020-0003。（2）主要材料表儿茶素，纯度≥98.0%（北京索莱宝科技有限公司）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（增强型）、一抗稀释液（碧云天生物技术）；通用型抗体稀释液（新赛美生物科技有限公司）；兔抗大鼠β⁃tublin 抗体；兔抗大鼠Caspase⁃3 抗体，兔抗大鼠Bax 抗体，兔抗大鼠Bcl⁃2 抗体（华安生物）；Dylight 800 标记山羊抗兔二抗（CST 公司）。

1.2 实验方法 （1）动物分组与造模将大鼠随机分为假手术组（Sham 组）、模型组（I/R 组）、EC5mg/kg 组、EC10mg/kg 组、EC20mg/kg 组、依达拉奉（ED）3mg/kg 组，每组9 只。除Sham 组外，其余组采用线栓法制备大脑中动脉栓塞模型（MCAO）［2］，大鼠经腹腔注射2%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉后，仰卧位固定，颈部去毛，消毒，纵向切开颈部正中皮肤，结扎颈外动脉，在颈总动脉上距离颈内动脉交叉处5 mm造口，插入线栓至有微弱阻力时停止，扎紧线栓，缺血2 h 后拔栓，假手术组仅结扎而不进行栓塞操作，各组术后于23±2℃温度条件下喂养，正常饮食进水。（2）给药EC5mg/kg 组、EC10mg/kg 组、EC20mg/kg 组分别于再灌注后0 h、12 h、24 h 三个时间点腹腔注射5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg 剂量的表儿茶素，ED 组腹腔注射3 mg/kg的依达拉奉，Sham 组和I/R 组注射同体积的生理盐水。（3）神经功能评分与脑指数依照modified neu⁃rological severity scores（mNSS）［3］评 分 法，于 再 灌注后12 h、24 h 分别进行评分，评分越高，神经功能损伤越严重。各组大鼠处死后，迅速取出大脑，快速称取大脑湿质量并计算脑指数，脑指数=湿脑质量/体质量×1000‰。（4）Tunel 染色法观察缺血侧脑组织神经元凋亡情况经甲醛灌注后取脑，固定，包埋，切片，按TUNEL 检测试剂盒说明书进行操作。病理显微镜下观察，400倍视野下随机选取5个不同视野，计算凋亡指数（凋亡指数=凋亡神经元数/神经元总数×100%）。（5）Western Blot 检测缺血侧脑组织皮质区Caspase⁃3、Bax、Bcl⁃2 蛋白表达水平提取缺血侧脑皮质总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，蛋白变性，上样，电泳，转膜，封闭，抗体孵育，扫膜，以β⁃tublin 为内参，Image J 软件测定条带灰度值，以目标蛋白与内参的比值作为蛋白相对表达水平。

1.3 统计学分析用 SPSS 22.0 软件对实验数据进行统计学分析，计量资料用（±s）表示，多组实验采用单因素方差分析，方差齐时多重比较采用LSD 法；方差不齐则采用Welch 检验，若差别有统计学意义，多重比较则用Tambane's T2，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 对神经功能缺损mNSS 评分及脑指数的影响 见表1。

表1 EC 对大鼠CIRI 后神经功能mNSS 评分及脑指数的影响（± s，n=9）

表1 EC 对大鼠CIRI 后神经功能mNSS 评分及脑指数的影响（± s，n=9）

注：与sham 组比较，*P＜0.05；与I/R 组比较，#P＜0.05

组别Sham 组I/R 组EC5mg/kg 组EC10mg/kg 组EC20mg/kg 组ED3mg/kg 组12 h 0 6.67±1.03*5.67±1.21 5.25±1.17#4.92±0.66#5.08±0.39#24 h 0 7.73±1.17*6.92±1.36 5.25±1.25#5.17±1.17#5.5±1.05#脑指数（‰）8.90±0.40 8.89±0.84 9.18±0.99 9.21±0.23 8.46±0.23 9.46±0.62

2.2 对缺血侧脑组织皮质区细胞凋亡的影响经Tunel 染色后，正常的细胞核为蓝色，凋亡细胞核为棕褐色。结果显示，Sham 组无明显凋亡，I/R 组神经元凋亡指数明显增大（P＜0.05）；与I/R 组比较，EC5mg/kg 组、EC10mg/kg 组、EC20mg/kg 组、ED3mg/kg 组凋亡指数明显减小（P＜0.05）。见图1、表2。

2.3 对缺血侧脑组织皮质区Caspase⁃3、Bax、Bcl⁃2 蛋白相对表达水平的影响 见图2。

图1 Tunel 染色检测缺血侧脑组织皮质神经元凋亡情况（400×，n=5）

表2 EC 对缺血侧脑组织皮质区神经元凋亡指数的影响（±s，n=5）

表2 EC 对缺血侧脑组织皮质区神经元凋亡指数的影响（±s，n=5）

注：与sham 组比较，*P＜0.05；与I/R 组比较，#P＜0.05

凋亡指数（%）1.42±0.40 49.88±3.89*42.91±1.02#26.96±3.85#14.83±1.94#15.61±2.29#组别Sham 组I/R 组EC5mg/kg 组EC10mg/kg 组EC20mg/kg 组ED3mg/kg 组

3 讨 论

脑缺血再灌注损伤是引发临床脑卒中的重要因素，其损伤机制十分复杂，包括氧化应激、能量障碍、钙超载等病理生理过程，这些环节互为因果，相互联系，形成恶性循环。因此，研究改善CIRI 的药物是极其重要的。

已有研究表明，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）预处理可通过抑制炎症反应和细胞凋亡减轻大鼠肾缺血再灌注损伤［4］。ED 临床上常用于治疗脑卒中，因此作为本研究的阳性药物，研究发现，造模后，EC、ED 组大鼠神经功能缺损评分降低，神经元凋亡指数显著降低，表明EC 能对CIRI后大鼠发挥抗凋亡作用。这与Young 等［5］的研究结果一致。

缺血再灌注损伤后，最终会导致细胞最终凋亡或坏死。细胞凋亡是由基因控制的细胞死亡，促凋亡蛋白Bax 和抗凋亡蛋白Bcl⁃2 等在凋亡信号转导途径中发挥关键的作用。缺血再灌注损伤时，凋亡信号被激活，Bax 蛋白进入线粒体中，破坏线粒体膜的完整性诱导凋亡的发生。Bcl⁃2作为目前研究最深入、最广泛的凋亡调控基因之一，是最重要的抗凋亡基因，可通过调节线粒体膜的通透性、直接控制ROS 的产生、维持细胞钙离子稳态来发挥抗凋亡的作用。Caspase⁃3 是凋亡过程的主要执行者，它的活化是细胞凋亡的重要标志［6］。表儿茶素，一种黄酮类化合物，已有研究表明，在乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤小鼠模型中，EC 可减少Caspase⁃3、Bax 蛋白的表达，增加Bcl⁃2 蛋白的表达，从而减轻肝损伤［7］。本研究也发现，EC、ED组Caspase⁃3、Bax 蛋白表达减少，Bcl⁃2 蛋白表达增加，与Cai［8］等研究结果一致。由此表明EC 可通过减少促凋亡蛋白Caspase⁃3、Bax 的表达，增加抗凋亡蛋白Bcl⁃2 的表达，从而抑制神经元凋亡发挥脑保护作用。

图2 EC 对CIRI 后大鼠缺血侧脑组织皮质区凋亡蛋白的影响（n=3）