水稻OsENOD93b基因组织表达模式与生物信息学分析

何雨航 杜易桓 郭昊 赵頔 马银花

摘要：主要探究OsENOD93b基因在水稻中的组织表达模式，并对其作生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR技术分析OsENOD93b基因的表达模式。用ExPASy-Protparam、Protscale、CDD、SOPMA、Phyre 2、Psort等在线工具对OsENOD93b进行生物信息学分析。经组织表达模式分析可知，OsENOD93b基因在叶片中的含量最多，其次是茎，含量最少的为根。通过ExPASy-Protparam分析发现，OsENOD93b分子量为16.429 89 ku，是一种具有亲水性的不稳定的碱性蛋白。该蛋白属于ENOD93超级家族。通过SOPMA在线软件对OsENOD93b蛋白的二级结构进行分析预测，发现其由无规则卷曲（41.56%）、α-螺旋（39.61%）、延伸链区（14.94%）和β-转角（3.90%）4种形式组成。此外，利用不同在线工具对OsENOD93b蛋白的三级结构、保守区域、亚细胞定位进行生物信息学分析。结果表明，OsENOD93b基因在进化过程中具有一定的保守性，并有多样的潜在功能待研究。研究结果为进一步探明OsENOD93b基因的生物学功能提供了依据。

关键词：水稻;ENOD;OsENOD93b;组织表达模式分析;生物信息学

中图分类号： Q78文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）07-0067-04

收稿日期：2020-08-25

基金项目：湖南省自然科学基金（编号：2019JJ50281）;湖南省教育厅项目（编号：18B455）;国家级大学生创新创业训练计划平台项目（编号：201910553027X ）。

作者简介：何雨航（1999—），女，湖南邵阳人，主要从事水稻遗传及转基因方面的研究。E-mail：1835147713@qq.com。

通信作者：馬银花，博士，讲师，主要从事水稻遗传及转基因方面的研究。E-mail：mayinhua1988@126.com。

水稻（Oryza sativa L.）是稻属谷类作物，这类经济作物需要吸收氮素合成自身需要的营养物质，因此对水稻结瘤固氮潜能进行研究具有重大的经济意义[1-2]。生物学上一般把宿主植物基因编码的根瘤特异性蛋白统称为结瘤素，编码这些物质的基因称为结瘤素基因[3]。按照结瘤素基因出现的早晚和功能不同，将其分为早期结瘤素基因、晚期结瘤素基因[4-5]。根据不同结瘤基因突变体对结瘤过程的影响，将结瘤基因分为共同结瘤基因、寄主专一性基因、调节基因三大类[6]。早期结瘤素基因参与根瘤菌的侵染和根瘤发育过程，而晚期结瘤素基因主要负责根瘤的功能[7]。早期结瘤素基因包括豌豆（Pisum sativum L.）中的PsSYM10、PsENOD5、PsENOD12A，大豆[Glycine max （Linn.） Merr.]中的ENOD2B、蜡梅[Chimonanthus praecox （Linn.） Link.]中的CpNOD等。晚期结瘤素基因有紫云英（Astragalus sinicus L.）的AsⅡC259、AsG2511、AsNODF32及百脉根（Lotus corniculatus Linn.）的LjCyp5等[8-15]。到目前为止，大豆早期结瘤素中研究得最清楚的是N-75基因，晚期结瘤素中研究得较清楚的是豆血红蛋白，它是豆科植物根瘤内的一种血红蛋白，主要功能是运输氧、降低拟菌体周围的氧分压[4]。

利用ENODZ的mRNA作探针进行研究发现，在豌豆、菜豆及苜蓿中都有1段与ENODZ同源的基因。另外有据报道显示，不同宿主植物内含有的早期结瘤素基因的类型不同，但均含有Enod2、Enod5、Enod12、Enod40[16-17]。ENOD93就是一种早期结瘤素，它在根瘤形成过程中的作用机制及在非豆科植物中的功能并不明确，还有待进一步的研究[4]。此外，Sym（symbiotic）基因也属于早期结瘤素基因，它是一类存在于豌豆中的共生基因[18]。

研究人员利用生物信息学方法证明，水稻基因组有31个基因与结瘤素基因具有高度同源性，如水稻基因CAC39050、S23543、BAB63833、BAB93352与结瘤素基因的同源性高达70%以上[7]。据报道，大豆早期结瘤素基因Gmenod40和水稻早期结瘤素基因Osenod40的表达模式相似[19-20]。此外，已发表的文献显示，豆科植物苜蓿的早期结瘤索基因Mrenod40在水稻、苜蓿中的表达方式相同[2，21]。水稻结瘤素的研究对于提高水稻产量和经济价值有着举足轻重的作用，发现更多具有特异性功能的结瘤素家族成员也是目前研究的重要任务。

本试验以水稻为研究对象，对筛选出的OsENOD93b（LOC_Os02g13380）进行理化性质分析与亲水性疏水性、保守区域、蛋白二级、三级结构预测，并进行亚细胞定位，以期为深入研究该基因提供理论依据，丰富水稻结瘤素基因家族的种类。

1 材料与方法

1.1 OsENOD93b蛋白的生物信息学预测

OsENOD93b蛋白的理化性质使用线上工具ExPASy-Protparam进行分析;亲水性、疏水性使用Protscale线上软件进行分析;蛋白保守功能区通过CDD软件进行在线分析;蛋白二级结构使用线上工具SOPMA进行分析;蛋白三级结构通过Phyre 2软件进行预测，蛋白亚细胞定位使用在线网站 Psort进行分析。上述各软件的网址见表1[22]。

1.2 OsENOD93b组织表达模式分析

首先进行水稻各组织器官总RNA的提取，其次，将获得的RNA进行反转录形成cDNA，以此进行组织表达模式分析，具体步骤参考Ma等的方法[23-24]。

2 结果与分析

2.1 OsENOD93b蛋白理化性质分析与亲水性预测

ExPASy-Protparam线上软件的分析结果表明，OsENOD93b是1个由154 个氨基酸构成、分子式为C711H1 181N227O210S5、相对分子量为16.429 89 ku、理论等电点（theoretical pI）为11.42的蛋白质。该蛋白质富含强碱性氨基酸[包括精氨酸（Arg）、赖氨酸（Lys）等，共计23 个]，且含有大量强酸性氨基酸[包括天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu），共计9个]。OsENOD93b蛋白的不稳定指数为67.09，表现出不稳定性，其脂肪系数为 81.88。表2关于氨基酸组成的分析结果显示，丙氨酸（Ala）、精氨酸、丝氨酸（Ser）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）、缬氨酸（Val）所占比例较高，分别为14.9%、104%、9.1%、7.1%、7.1%、6.5%、6.5%，色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）所占比例较低，都为0.6%。用Protscale线上工具对OsENOD93b蛋白的亲水性进行预测，发现OsENOD93b蛋白的氨基酸组成中既有亲水氨基酸，又有疏水氨基酸（图1），其中主要包含亲水性氨基酸，因此判断该蛋白为亲水性蛋白。综上，OsENOD93b蛋白是1个具有亲水性的不稳定的碱性蛋白。

2.2 OsENOD93b蛋白的保守域

用CDD在线软件对OsENOD93b蛋白的保守功能域进行预测，由图2可知，OsENOD93b基因的特定匹配（specific hits）和非特定匹配（non-specific hits）都在ENOD93，且该蛋白属于ENOD93 superfamily（ENOD93超级家族）。

2.3 OsENOD93b蛋白的二级结构

利用线上工具SOPMA预测OsENOD93b蛋白的二级结构。由图3可以看出，OsENOD93b蛋白的二级结构主要由无规则卷曲（41.56%）、α-螺旋（39.61%）、延伸链区（14.94%）和β-转角（390%）组成。因此可知，该蛋白的空间构象可能主要由无规则卷曲结构构成。

2.4 OsENOD93b蛋白的三级结构预测

利用线上工具Phyre2预测OsENOD93b蛋白的三级结构。由图4可以看出，该蛋白只含有1条肽链，没有三级结构，说明该蛋白空间构象较简单，且不能折叠形成特异的空间构象。

2.5 OsENOD93b蛋白的亚细胞定位

通过线上工具Psort对OsENOD93b蛋白进行亚细胞定位，结果（表3）表明，该蛋白定位在线粒体的可能性为30.4%，定位在细胞质的可能性为26.1%，定位在细胞核、内质网、高尔基体、液泡、分泌系统囊泡、细胞外（包括细胞壁）等地方的可能性分别为 8.7%、8.7%、8.7%、8.7%、4.3%、4.3%。根据上述数据推测，OsENOD93b蛋白定位在线粒体的可能性最大，其次是细胞质，也可能是胞核、内质网、高尔基体、液泡、分泌系统囊泡和细胞外（包括细胞壁）。

2.6 OsENOD93b基因组织表达模式分析

首先，通过特定方法提取水稻根、茎、叶的RNA，将其反转录成cDNA。其次，利用实时荧光定量PCR的方法，检测OsENOD93b基因在不同组织器官中的表达水平。研究结果显示，OsENOD93b 基因的总体表达水平相对较高，在根、茎、叶器官中均有表达，在叶中的表达量最高，其次是茎中，表达量最少的为根中（图5）。上述结果表明，OsENOD93b的功能在不同植物中可能具有一定的潜在多样性。

3 讨论

本研究发现，OsENOD93b在水稻根、茎、叶中有不同水平的表达，在叶中的表达量最高，在根、茎中的表达量相对较低。但是根据其在各组织中均有表达，且相对表达量较高的情况来看，OsENOD93b基因在水稻早期结瘤素家族中有着举足轻重的地位。因此，对OsENOD93b表达的特异性进行详细研究，有助于探明OsENOD93b蛋白功能的特异性。

生物信息学分析发现，OsENOD93b蛋白是一个亲水的、不稳定的碱性蛋白，属于ENOD93 superfamily（ENOD93超级家族）。蛋白二级结构预测发现，该蛋白晶体的空间构象可能是以无规则卷曲结构构成的;OsENOD93b蛋白没有三级结构，由1条链组成;此外，OsENOD93b蛋白定位预测结果表明，它定位于线粒体的可能性最大，比定位在细胞质的可能性更大。由此可见，OsENOD93b蛋白极有可能在线粒体中表达其功能。但目前尚未发现OsENOD93b在线粒体中的详细功能。后续将对OsENOD93b进行功能性研究，以期发现对未来新型水稻品种有利的功能。

4 结论

组织表达模式分析结果表明，OsNOD93b参与各组织的表达，在叶中的表达明显。通过ExPASy-Protparam在线软件预测可知，OsNOD93b是一个具有亲水性、保守的、碱性的、不稳定的蛋白分子，亚细胞定位预测结果显示，该蛋白可能在定位线粒体中，以高水平、保守的方式调控水稻的重要生物学功能及作用机制。

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