体外模拟消化对藜麦抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性影响研究

王 静 刘丁丽 罗 丹 成 婧 陆 俊 Otobong Donald Akan 罗非君

(林产可食资源安全与加工利用湖南省重点实验室1，长沙 410004)(中南林业科技大学食品科学与工程学院2，长沙 410004)(中国农业科学研究院农产品加工研究所3，北京 100193)(湖南省检验检疫科学技术研究院4，长沙 410004)

近年来，由于谷物食品对糖尿病、肥胖症、心血管疾病等与生活方式和饮食习惯相关的疾病具有潜在抑制作用而被视为健康食品。因此，从谷物中发现的具有保健功效的生物活性成分已成为越来越多科研工作的研究热点。藜麦(ChenopodiumQuinoawild)原产于南美洲安第斯山脉，是安第斯人的传统主食，与其他常见谷物相比，藜麦营养价值更高，含有60%左右的淀粉类化合物、约15%的优质蛋白质、约10%的脂质且主要为不饱和脂肪酸，核黄素、维生素E、叶酸等维生素类物质也高于一般谷物、富含矿物质(钙、镁、铁、钾等)等成分，近年来引起了广泛关注并被其他国家引种，在我国青海、西藏、山西等地均有种植。许多地区将藜麦看作一种“功能性食品”[1]，因其具有抑制前列腺癌细胞增殖[2]，调节血糖，降低胆固醇，保护心脑血管等诸多益处[3]。研究表明，藜麦的主要活性成分有多酚、黄酮、皂苷、多糖和可溶性纤维[4]，其多酚含量与抗氧化能力呈正相关[5]。多酚具有清除自由基、减少体内外氧化损伤、预防机体发生与氧化有关的慢性疾病等能力[6]，而藜麦种子中含有槲皮素、山奈酚、香草醛酸、阿魏酸、阿魏酸-4-葡萄糖苷等多种酚类化合物[7，8]。此外，有报道称酚类化合物可作为糖苷酶抑制剂，用于降低由肠道淀粉消化引起的餐后高血糖[9，10]。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是参与小肠碳水化合物消化降解的关键酶[11]，抑制它们的活性就可以减缓淀粉分解，降低糖尿病患者餐后血糖水平。

现阶段，藜麦研究大多数集中在其物理和化学特性[12，13]、营养成分、功能性[14]、加工工艺对活性成分的影响[15，16]等方面。大多数生物活性物质在发挥其生物活性之前都要经过胃肠道消化，不同产地、不同研究得到的藜麦功能活性成分含量也不尽相同。因此，本研究旨在探讨经过体外模拟胃肠道消化，藜麦中的酚类化合物、黄酮类化合物、抗氧化作用以及对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制作用的差异，为藜麦作为功能性食品原料改善人体健康提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3种脱壳藜麦(均为白藜麦)分别产自青海、山西和玻利维亚(进口)。福林-酚试剂、ABTS(超纯)、芦丁(≥98%)、没食子酸(≥99.3%)、儿茶素(≥98%)、水溶性维生素E(≥98%)、2, 4, 6-三吡啶三嗪(tripyridyltriazine，TPTZ，≥98%)、DPPH(>97%)；猪胰酶(250 N.F.U/mg)、胃蛋白酶(800～2 500 U/mg)、α-淀粉酶(>10 U/mg)、α-葡萄糖苷酶(>50 U/mg)、透析袋(YA1082-5M，MWCO 1000)，其他试剂为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV1800紫外可见分光光度计,JY92-Ⅲ超声波细胞粉碎机,AuY220电子分析天平。

1.3 方法

1.3.1 未消化样品的制备

准确称取10 g藜麦种子粉末(40目)放入锥形瓶中，加入50 mL含0.1% HCl的70%甲醇溶液，在500 W下超声40 min，在12 000 r/min下离心15 min，取上清液，按照相同步骤再次提取沉淀物，合并两次提取液作为藜麦未消化样品。

1.3.2 体外模拟胃、肠消化

根据Miller等[17]的方法作适当修改进行模拟消化。第一部分是模拟胃液消化，取20 g藜麦粉末和200 g生理盐水在烧杯中充分混匀，进行沸水浴并持续搅拌15 min。待样品溶液冷却后，加入去离子水调至220 g。用1 mol/L HCl将样品悬浊液的pH值调至2.0，再加入1 mL模拟胃液(0.5 g胃蛋白酶溶于5 mL 0.01 mol/L的HCl)。盐酸对照组用1.0 mL 0.01 mol/L的HCl代替模拟胃液，空白对照组用1 mL的去离子水替代盐酸和胃液。锥形瓶用锡纸包裹避光，在37 ℃、100 r/min的恒温培养振荡器中消化2 h，离心收集上清液，再加无水乙醇(最终浓度高达60%)并放入冰箱中反应6 h以除去糖和蛋白质，离心取上清液作为胃消化组、盐酸对照组和空白对照组样品进行分析。

第二部分是模拟肠道消化，透析袋中注入8 mL生理盐水和2.0 mL 0.1 mol/L NaHCO3溶液再将透析袋浸入上述胃消化液中，在37 ℃、100 r/min的振荡培养箱中振荡45 min。然后，在透析袋外的胃消化液中加入5 mL胰液胆汁混合液(0.4 g胰酶，2.5 g胆汁提取物溶于100 mL 0.1 mol/L的NaHCO3溶液中)模拟肠消化，肠空白组则加入5 mL 0.1 mol/L的NaHCO3溶液。两组均在37 ℃、100 r/min的恒温培养振荡器中消化2 h。最后，透析袋内外的液体去除蛋白，离心后留上清液备用，以透析袋外液分别作为肠消化组和肠空白组样品。

1.3.3 总多酚和总黄酮的测定

参考文献[18]测定总多酚(TPC)和总黄酮(TFC)，以没食子酸标准物质对多酚含量进行定量，结果表示为每克干重样品的没食子酸毫克当量(mg GAE/gmd)；用儿茶素标准物质对总黄酮进行定量，结果以每克干重样品中儿茶素毫克当量表示(mg CE/gmd)。

1.3.4 生物利用率的测定

生物利用率是指人体吸收利用的有效成分总量占食品中有效成分总量的比例[19]。通过一个简单的动力学模型，利用透析袋模拟胃肠道在体内的消化吸收，研究体外消化对藜麦营养物质吸收利用的影响。其生物利用率按式(1)计算。

(1)

式中：C1和C2分别为透析袋内、透析袋外的TPC或TFC/mg。

1.3.5 抗氧化活性的测定

选择常用的三种抗氧化方法DPPH，ABTS，FRAP进行抗氧化活性的测定，具体操作根据文献[18]进行，用Trolox 作标准物质，结果以每克干重样品中微摩尔Trolox当量表示(μmol TE/gmd)。

1.3.6 α-葡萄糖苷酶的抑制活性的测定

根据Yang等[20]的方法测定α-葡萄糖苷酶的抑制活性。200 μL样品提取液和200 μL 0.01 mg/mL α-葡萄糖苷酶(溶于0.01 mol/L pH=6.8磷酸钠缓冲溶液)，37 ℃反应15 min，再加入200 μL 2.5 mmol/L 对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖(pNPG)溶液。37 ℃反应10 min后，加入5 mL 0.10 mol/L NaCO3溶液终止反应，在400 nm处测定吸光度A。空白组用去离子水代替样品提取液，对照组用缓冲液代替酶。抑制率的计算见式(2)。

表1 藜麦的TPC、TFC以及抗氧化活性

α-葡萄糖苷酶的抑制率=

(2)

1.3.7 α-淀粉酶抑制活性测定

α-淀粉酶抑制活性根据Tao等[21]的方法测定。1.0 mL样品提取液与0.3 mL的α-淀粉酶(溶于pH=6.8的磷酸盐缓冲液)在37℃下放置5 min，加0.4 mL 1%淀粉溶液在37℃下反应15 min。再加入0.5 mL DNS试剂(1.575 g 3,5-二硝基水杨酸溶于5.25 g的NaOH溶液中，加入含有45.5 g酒石酸钾钠热溶液125 mL，再加入1.25 g苯酚和1.25 g亚硫酸钠，搅拌均匀加热至溶解，冷却后定容至250 mL，储存于棕色瓶中，放置一星期后使用)，混合溶液沸水浴5 min，冷却至室温，去离子水定容至25 mL，在540 nm处测量吸光度。用去离子水代替藜麦提取液作为空白组，去离子水代替α-淀粉酶溶液作对照组，抑制率按式(3)计算。

α-淀粉酶的抑制率=

(3)

1.3.8 统计分析

所有实验做3次平行，所得数据用平均值±标准差(SD)表示。采用SPSS17.0进行统计分析，采用Spearman相关系数进行相关性检验。P<0.05表示有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 藜麦提取物的总酚、总黄酮含量及抗氧化活性

经过超声波辅助酸化甲醇提取后，藜麦的TPC、TFC和抗氧化活性结果如表1所示。3个品种中，青海藜麦的TPC最高，玻利维亚藜麦的TPC最低，其值均高于意大利皮亚琴察(Piacenza)藜麦粉的多酚含量(87.2 mg/100 g)[22]。青海、山西、玻利维亚藜麦的TFC含量远高于Abderrahim等[23]的报道(47～255 mg/100 g)。在一定程度上，不同的提取方法、不同产地或藜麦的基因型可能会造成这种差异。3种藜麦的抗氧化活性也存在一定差异，DPPH自由基清除活性从高到低依次为青海藜麦>山西藜麦>玻利维亚藜麦(表1)。ABTS自由基清除活性则依次为山西藜麦>青海藜麦>玻利维亚藜麦。FRAP法所得结果与ABTS有相似的趋势，山西藜麦的抗氧化活性最高，玻利维亚藜麦的抗氧化活性最低，与Zhao等[24]的结果(12.74～16.57 μmol TE/gmd)相近，高于秘鲁高原的黄色藜麦[(12.5±2.3)μmol TE/g]和紫红色藜麦[(18.4±1.7)μmol TE/g]的值[25]。抗氧化活性之间的差异可能是由于多酚和类黄酮等抗氧化活性物质含量的不同引起的，也可能是由产地、提取方法、品种等差异造成的。

2.2 模拟消化后总酚、总黄酮的释放及生物利用率

3种藜麦在体外模拟消化后的TPC和TFC含量如图1所示。随着消化的进行，TPC和TFC含量均逐渐升高。在胃消化过程中，青海、山西、玻利维亚藜麦的TPC分别比未消化组增加了102.73%、91.07%、168.93%，TFC分别比未消化组增加了127.03%、113.31%、194.36%。其中玻利维亚藜麦胃消化后的TPC和TFC增幅最大，而青海藜麦的值最高。虽然青海藜麦、山西藜麦的盐酸组和胃消化组的TFC无显著性差异，但胃消化组的TFC值仍高于盐酸组。在胃蛋白酶催化作用下，可能会使更多的多酚和黄酮释放到模拟胃液中。

肠消化过程中TPC和TFC持续升高。青海、山西、玻利维亚藜麦肠消化组的TPC分别比未消化组增加了202.41%、178.41%、270.38%，同时，TFC分别比未消化组增加了219.86%、236.79%和352.84%，也显著高于胃消化组。值得注意的是，除了青海藜麦和山西藜麦的TFC值外，肠消化组和肠空白组之间没有显著差异，这可能是由于空白组的碱性环境与模拟肠液中的胰酶等物质对多酚的释放有类似影响，或者是胰酶对TFC释放的影响较大，对TPC影响较小。

注：同一评价指标的不同字母表示存在显著性差异(P<0.05)，同一柱形图上的不同字母表示存在显著性差异(P<0.05)。图1 体外模拟消化前后藜麦的TPC和TFC

模拟胃肠体外消化后，3种藜麦的TPC和TFC值显著升高，这与Pellegrini等[26]所发现的变化趋势一致。消化组总酚含量的增加可能是由于胃蛋白酶的水解作用或碱性消化环境有利于酚类物质从复杂的食物基质中释放出来。同时，大多数肠消化组和肠空白组的TPC和TFC值无显著性差异，这可能是由于肠道消化组中的总酚和总黄酮转移到了透析袋里面。在整个胃肠消化期结束时，玻利维亚藜麦、山西藜麦和青海藜麦总酚的17.50%、19.02%和20.49%，总黄酮的32.15%，32.13%和32.00%进入到透析袋内，且略高于肠空白组，即这些成分是可以被吸收的。由此可知，体外消化可以提高藜麦活性物质在肠道水平上的消化吸收。

2.3 模拟消化对藜麦抗氧化活性的影响

模拟消化对藜麦抗氧化活性影响的结果如图2所示。抗氧化活性值随着消化过程的进行而逐渐升高，呈现出肠消化组明显高于胃消化组和未消化组的大致趋势。青海藜麦、山西藜麦和玻利维亚藜麦的DPPH抗氧化活性以肠消化组抗氧化活性最高，比相应的未消化组分别提高了124.27%、85.22%和96.39%，且显著高于相应的胃消化组。同样的，经肠消化后，3种藜麦的ABTS抗氧化活性分别比未消化组提高了86.38%、55.18%和37.36%。肠消化组的ABTS清除能力略高于肠空白组和胃消化组，这可能是因为在肠消化组有更多的抗氧化成分渗入透析袋导致透析袋外(即肠消化组)的抗氧化成分减少所致。FRAP抗氧化能力则表现出与DPPH法相似的趋势，但增长幅度较小。3种藜麦透析袋内溶液的抗氧化能力分别占透析袋外溶液总抗氧化能力的19.13%～23.16%(DPPH)，26.50%～32.47%(ABTS)，12.87%～17.58%(FRAP)，均略高于肠空白组，说明有更多的抗氧化成分进入透析袋并在肠消化时可发挥生物活性作用。

注：同一检测方法的不同字母表示存在显著性差异(P<0.05);同一柱形图上的不同字母表示存在显著性差异(P<0.05)。图2 体外模拟消化前后藜麦的抗氧化活性

这些结果表明通过胃蛋白酶、胰蛋白酶和胆盐的消化可能有助于将更多的酚酸、黄酮等抗氧化成分从藜麦种子中释放出来，而多酚物质与藜麦的抗氧化能力呈正相关，因此体外抗氧化活性也有所提高。在本研究中，Spearman相关性分析也证实了3种抗氧化活性(DPPH、ABTS和FRAP)与多酚之间的高度相关性(P<0.01)(相关系数分别为0.913，0.960和0.933)。

2.4 藜麦对α-葡萄糖苷酶抑制作用

消化的各个阶段，3种藜麦对α-葡萄糖苷酶抑制作用的结果如图3所示。所有受试组对α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力均呈现剂量依赖性关系(图3)。未消化组中，以玻利维亚藜麦的抑制能力最强，IC50值最低(27.43 mg/mL)。模拟胃消化后，3种藜麦在各个浓度下对α-葡萄糖苷酶的抑制活性均明显增强，仍以玻利维亚藜麦抑制能力最强，具有最低IC50值(21.90 mg/mL)。同时，所有实验组的IC50均低于相应的未消化组。在进一步模拟肠道消化后，IC50值继续下降，表明其比胃消化组的抑制活性更强，以山西藜麦肠消化组的抑制活性最强，IC50值最低(16.24 mg/mL)。这些结果表明，模拟胃肠道消化后，藜麦对α-葡萄糖苷酶的抑制活性明显增强。

图3 体外模拟消化前后藜麦对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响

2.5 藜麦对α-淀粉酶的抑制活性

3种藜麦对α-淀粉酶的抑制活性也均呈现剂量效应关系(图4)。3种藜麦未消化组的IC50为11.43～27.43 mg/mL，低于抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值，说明藜麦对α-淀粉酶的抑制能力强于α-葡萄糖苷酶。经胃消化后，抑制活性略有提高，3种藜麦的IC50值均低于未消化组，同样的，胃消化组中抑制α-淀粉酶的IC50值也低抑制于α-葡萄糖苷酶的IC50值。综上可知，在模拟胃液消化的条件下，藜麦胃消化产物对α-淀粉酶的抑制活性明显增强，且相比α-葡萄糖苷酶，对α-淀粉酶的抑制能力更强。

图4 体外模拟消化前后藜麦对α-淀粉酶抑制率的影响

然而，藜麦对α-淀粉酶的抑制活性并没有随着消化的进行而继续提升，反而有所降低。在模拟肠道消化阶段，玻利维亚藜麦在20 mg/mL时抑制率为59.46%，明显低于胃消化组的75.13%。 相应的IC50值为10.67 mg/mL，也显著大于胃消化组的IC50(6.53 mg/mL)。青海藜麦和山西藜麦与玻利维亚藜麦有相似的趋势，IC50分别为8.17、9.17 mg/mL，均略高于各自胃消化组的IC50(分别为6.77、6.99 mg/mL)。这些结果表明，经过肠消化，藜麦对α-淀粉酶的抑制活性有所降低。这有可能是部分具有抑制α-淀粉酶活性的成分由透析外液进入透析袋内，引起透析外液(肠消化组)抑制活性减弱，同时的透析袋内的抑制活性增强(3种藜麦透析袋内液的IC50值分别为7.34、5.40、6.23 mg/mL)。这些结果也表明，藜麦肠消化后更容易被肠道利用以发挥其抑制α-淀粉酶的活性。此外，比较两种酶的IC50值可知所有藜麦的肠道消化组对α-淀粉酶的IC50值均显著低于α-葡萄糖苷酶，表明藜麦消化后对α-淀粉酶的抑制活性要强于对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制剂可以减缓肠道内碳水化合物的消化从而降低餐后血糖浓度。藜麦对α-淀粉酶的抑制作用鲜有文献报道。Hemalatha等[27]研究了印度白藜麦麸皮和壳提取物对α-淀粉酶(IC50值分别为108.68和148.23 μg/mL)和α-葡萄糖苷酶(IC50值分别为62.1和68.14 μg/mL)的抑制作用，并证明其与高含量的总酚和总黄酮有关。抑制活性的不同可能与提取物是否消化或抑酶活性的测量条件不同有关。研究结果表明，体外消化后藜麦酚类物质释放量增加，对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性更接近真实水平，尤其是透析袋中TPC和TFC的利用率适中，IC50值较低。因此，藜麦有潜力作为替代的功能食品，延缓膳食中碳水化合物的吸收，从而抑制餐后血糖水平的升高。

3 结论

本实验利用体外模拟消化研究藜麦消化前后多酚、黄酮的变化情况及其抗氧化能力、抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的变化，结果表明，3种藜麦在消化前后均具有抗氧化能力、抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的能力。消化前，青海藜麦、山西藜麦总多酚、总黄酮及抗氧化能力均优于进口的玻利维亚藜麦。模拟消化后，3种藜麦的总酚和总黄酮含量显著增加，生物利用率提高，DPPH、ABTS、FRAP方法测得的抗氧化活性有相似的变化趋势且抗氧化活性都显著增强，对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制作用也显著增强，后续可研究藜麦有效成分的具体组成及利用动物模型进一步验证藜麦对血糖的调节能力。