黄芪甲苷通过mTORC1通路调控IgA肾病大鼠脾淋巴细胞分化①

彭胜男 陶琰心洪婷 杨海燕 黄青（江西中医药大学科技学院临床医学系，南昌 330004）

IgA肾病（IgA nephropathy，IgAN）又称Berger病，是最为常见的原发性肾小球疾病。文献报道，与健康志愿者相比，IgAN患者血清IL‐10水平较高，血清可溶性生长刺激表达基因2蛋白（growth stimulation expressed gene 2 protein，sST2）浓度与IL‐10水平、24 h尿蛋白和血清IgA水平呈正相关［1］。治疗后血清sST2水平显著降低，血清IL‐10水平显著升高。故推测sST2和IL‐10参与IgAN发病过程。研究发现，IgAN大鼠p70S6K磷酸化水平较对照组显著上调，雷帕霉素可有效抑制p70S6K磷酸化，低剂量mTOR抑制剂雷帕霉素可抑制IgA沉积，减少蛋白尿、系膜细胞激活及细胞外基质分泌，保护肾功能［2］。故推测Akt/mTOR/p70S6k通路在IgAN中被激活。

依据国际共识对IgAN的定义，IgAN的诊断标准是免疫荧光检查可见肾小球系膜区出现IgA或以IgA为主的免疫复合物沉积，以此证明造模成功［3］。亚洲地区IgAN发病率高达30%～40%，常会发展为终末期肾脏病［4］。目前IgAN的发病机制尚未明确，研究认为IgAN患者常伴有胃肠道感染或上呼吸道感染，外源性致病抗原穿过黏膜屏障作用于黏膜细胞或B细胞，导致IgA1分子绞链区O‐聚糖半乳糖缺失，导致其糖基化异常，异常糖基化的IgA1分子刺激机体产生大量IgG和IgA抗体，在血清中形成IgA1免疫复合物，最后沉积于肾小球系膜区导致肾脏损伤。因此，减少异常IgA1生成是IgAN治疗的关键靶点。脾脏是机体最大的免疫器官，含有大量B淋巴细胞和巨噬细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心。mTOR与B细胞分化密切相关。结节性脑硬化复合物1（tuberous sclerosis complex‐1，TSC1）是mTOR上游的负性调控因子，敲除小鼠B细胞中的TSC1可导致B细胞成熟障碍。Akt激活时其边缘区B细胞明显减少，而mTOR抑制剂雷帕霉素可部分缓解边缘区B细胞减少，证明mTOR与B细胞增殖密切相关［5］。LPS可作为免疫佐剂，破坏肝脏的内皮网状系统，减少IgA清除。目前，IgAN的治疗方式主要有糖皮质激素、抗感染、抗凝、免疫抑制剂、扁桃体摘除术、血浆置换、血管紧张素转换酶抑制剂等，但效果较差［6］。IgAN患者扁桃体内含有异常糖基化的IgA1，因此临床常采取扁桃体摘除术治疗IgAN，减少异常IgA1产生，减轻免疫炎症反应，恢复机体免疫平衡。黄芪治疗IgAN已有报道，黄芪颗粒联合厄贝沙坦治疗IgAN可有效调节免疫力，减少感染，降低蛋白尿水平，提高临床疗效［7］。黄芪甲苷（astragalosideⅣ，AS）是黄芪的重要药理成分，具有免疫调节作用，可减少异常IgA生成，抑制免疫炎症因子产生，减轻炎症反应。本研究探讨AS对IgAN大鼠脾淋巴细胞分化的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物28只清洁级SD大鼠，体重（200±20）g，购自南昌大学医学实验动物科学部。

1.1.2 主要试剂AS购自南京泽朗医药科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA）购自Roche公司；脂多糖（LPS）购自Sigma公司；四氯化碳（CCl4）、蓖麻油购自上海实验试剂有限公司；RAPA购自上海源叶生物科技公司；异硫氰酸荧光素（FITC）标记的IgA抗体和IL‐10抗体购自Abcam公司；CD4抗体和p‐p70S6k抗体购自Cell signaling公司；CD8抗体购自Biolegend公司；p‐mTOR抗体购自Thermo Fisher公司；IgG二抗、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物公司。

1.2 方法

1.2.1 分组及造模SD大鼠随机分为4组：对照组、IgAN模型组、RAPA组和AS组，每组7只。采用BSA+LPS+CCl4联合构建IgAN大鼠模型，第1～6周隔天灌胃给予BSA（400 mg/kg），第6周和第8周末尾静脉注射LPS（0.05 mg/只），第1～9周每周末皮下注射CCl4（CCl40.1 ml/只+蓖麻油0.5 ml/只）。RAPA组SD大鼠造模第7周灌胃给予RAPA 1 mg/（kg·d），1次/d，连续4周，其余同IgAN组。AS组大鼠建模过程中灌胃给予AS，前6周采用1%AS混悬液配制BSA，其他操作与IgAN组相同，第7周开始灌胃给予AS 50 mg/（kg·d），1次/d，连续4周，对照组除给予等量生理盐水，其他操作与IgAN组相同。所有大鼠标准喂食，第10周股动脉取血，快速取脾脏和肾脏，脾脏用4%多聚甲醛固定，用于免疫组化和病理观察。肾皮质在置于冰上，迅速制成冰冻切片，用于免疫荧光观察。

1.2.2 肾组织免疫荧光观察取肾皮质制成8µm冰冻切片，丙酮固定10 min，PBS洗3次，5 min/次，加入正常山羊血清，37℃孵育45 min，甩干，勿洗，滴加FITC标记的IgA抗体（1∶100），避光操作，4℃孵育过夜，PBS冲洗3次，5 min/次，晾干，封片，荧光显微镜下观察。

1.2.3 脾组织病理观察取脾脏用4%多聚甲醛固定，脱水，透明，石蜡包埋，切片（5µm），HE染色，光学显微镜观察各组大鼠脾脏病理学变化。

1.2.4 脾CD4+T细胞数和CD8+T细胞数检测各组切片脱蜡，水化，微波修复抗原，滴加去离子水，再分别滴加CD4和CD8一抗，4℃孵育过夜，PBS冲洗3次，5 min/次，加入二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗3次，5 min/次，DAB染色，苏木素复染，脱水，透明，封片。普通光学显微镜高倍镜观察，每张切片随机选取10个视野观察并拍照，方网测试系统计数，并计算CD4+T细胞和CD8+T细胞数密度。

1.2.5 脾脏ⅠL‐10、p‐mTOR和p‐p70S6k表达切片脱蜡，水化，抗原修复，分别滴加IL‐10、p‐mTOR和p‐p70S6k抗体，4℃孵育过夜，PBS清洗，加入二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗，DAB显色，复染，脱水，透明，封片。高倍镜观察并拍照。采用Image‐Pro Plus 6.0软件进行分析，计算各视野阳性染色的积分光密度（IOD）并计算平均值。

1.3 统计学处理采用SPSS17.0软件进行统计学分析，数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾ⅠgA沉积对照组大鼠肾小球系膜区未见明显绿色荧光，IgAN组大鼠肾小球系膜区可见较强绿色荧光，提示造模成功。与IgAN组比，RAPA组和AS组大鼠肾小球系膜区绿色荧光强度减弱（图1），提示RAPA和AS可减轻IgAN大鼠炎症反应，减少肾小球系膜区IgA沉积，可能与中性粒细胞和单核细胞有关，此两类细胞均可高表达IgA可结晶片段受体（FcαR），前者可介导急性炎症，后者可介导慢性炎症。

2.2 大鼠脾脏病理学变化对照组大鼠脾组织结构清晰，白髓区内脾小体较小而少，主要为B淋巴细胞，一侧以中央动脉为中心，周围淋巴组织呈鞘状包绕，主要为T淋巴细胞。与对照组相比，IgAN组大鼠白髓区内脾小体体积增大。数量增多，生发中心更为明显，小结帽朝向边缘区，提示B淋巴细胞进一步增殖，一侧动脉周围淋巴鞘增厚，T淋巴细胞数增多，提示IgAN大鼠脾内体液免疫应答和细胞免疫应答均增强。与IgAN组相比，RAPA组和AS组大鼠脾小体增大增多和动脉周围淋巴鞘增厚情况减轻，提示RAPA和AS均可抑制IgAN大鼠脾内免疫应答，减轻免疫炎症反应（图2）。

图1 大鼠肾脏IgA免疫荧光染色（×400）Fig.1 IgA immunofluorescence staining of kidneys of rats（×400）

图2 大鼠脾脏病理学检查（×400）Fig.2 Pathological examination of spleen in rats

2.3 大鼠脾脏CD4+T细胞和CD8+T细胞免疫组化检测与对照组相比，IgAN组大鼠脾内CD4+T细胞数密度增加而CD8+T细胞数密度减少（P＜0.01）。与IgAN组比，RAPA组 和AS组大 鼠 脾内CD4+T细胞数密度均减少而CD8+T细胞数密度增加（P＜0.05）。提示IgAN大鼠脾内辅助性T细胞（Th）增多而抑制性T细胞（Ts）减少，免疫系统过度激活，AS和RAPA均可有效纠正免疫失衡，抑制免疫系统过度激活（表1、图3）。

表1 大鼠脾脏淋巴细胞数密度（±s，1×104个/μm3）Tab.1 Number density of lymphocytes in spleen of rats（±s，1×104 cell/μm3）

表1 大鼠脾脏淋巴细胞数密度（±s，1×104个/μm3）Tab.1 Number density of lymphocytes in spleen of rats（±s，1×104 cell/μm3）

Note：Compared with control group，1）P＜0.01；compared with IgAN group，2）P＜0.05.

CD8+T 1.01±0.12 0.64±0.131）0.92±0.111）2）0.96±0.251）2）Groups Control IgAN RAPA AS CD4+T 2.20±0.23 7.20±1.901）5.31±1.631）2）4.60±1.571）2）

图3 大鼠脾脏CD4、CD8 T细胞免疫组化染色（×400）Fig.3 Immunohistochemical staining of CD4，CD8 T cells in spleens of rats（×400）

图4 大鼠脾脏IL‐10、p‐mTOR、p‐p70S6k免疫组化染色（×400）Fig.4 Immunohistochemical staining of IL‐10，p‐mTOR，p‐p70S6k in spleens of rats（×400）

表2 大鼠脾脏IL‐10、p‐mTOR和p‐p70S6k表达（±s）Tab.2 Expressions of IL‐10，p‐mTOR and p‐p70S6k in spleen of rats（±s）

表2 大鼠脾脏IL‐10、p‐mTOR和p‐p70S6k表达（±s）Tab.2 Expressions of IL‐10，p‐mTOR and p‐p70S6k in spleen of rats（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.01；compared with IgAN group，2）P＜0.01.

p‐p70S6k（×103）46.69±25.89 65.11±32.431）22.17±11.841）2）40.10±24.062）Groups Control IgAN RAPA AS IL‐10（×103）10.02±4.97 4.94±2.261）6.33±1.771）2）7.10±2.121）2）p‐mTOR（×103）13.06±7.48 19.96±8.031）9.26±2.961）2）8.90±2.711）2）

2.4 大鼠脾脏ⅠL‐10、p‐mTOR和p‐p70S6k免疫组化检测与对照组相比，IgAN组大鼠脾脏内IL‐10水平下降（P＜0.01），而p‐mTOR和p‐p70S6k水平升高（P＜0.01）。与IgAN组比，RAPA组和AS组大鼠脾脏内IL‐10水平升高（P＜0.01），而p‐mTOR和p‐p70S6k水平下降（P＜0.01）。提示IgAN大鼠脾脏内免疫抑制因子IL‐10分泌减少，p‐mTOR和p‐p70S6k表达上调，mTORC1信号通路被激活。RAPA组和AS组大鼠脾脏内IL‐10分泌增多，且p‐mTOR和p‐p70S6k表达降低，mTORC1信号通路被抑制（图4、表2）。

3 讨论

IgAN是世界最常见的一种原发性肾小球肾炎，主要以肾小球系膜区IgA免疫复合物沉积为病理学特点［8］。本实验选用BSA+LPS+CCL4三联法造模，实验中对照组大鼠肾脏系膜区未见明显IgA沉积，而IgAN组大鼠肾脏系膜区出现不连续的颗粒状IgA沉积，提示造模成功。与IgAN组相比，RAPA组和AS组大鼠肾小球系膜区绿色荧光不同程度减弱，提示RAPA和AS均可减轻肾小球系膜区IgA沉积。

IgAN是一种自身免疫性疾病，引起IgAN的自身抗原主要是异常糖基化的IgA1，其形成可能与扁桃体炎、上呼吸道和胃肠道感染等黏膜免疫反应有关，在患者血清和肾小球系膜区均可检测到较高浓度的异常IgA1［9］。IgAN的发生与多种因素相关，如机体免疫失调、黏膜免疫异常、IgA分子结构异常、IgA免疫复合物清除障碍、遗传因素等，但具体发病机制尚未明确。可以肯定的是，IgA免疫复合物的大量产生和在肾小球系膜区沉积是发病关键。抑制过度免疫应答、减少IgA产生和在肾小球系膜区沉积、维持机体免疫平衡是治疗IgAN的重要思路。本研究HE染色切片观察到，与对照组相比，IgAN组大鼠脾脏白髓中脾小体增大增多，生发中心明显，动脉周围淋巴鞘增厚，与IgAN组相比，RAPA组和AS组大鼠脾小体增大增多和动脉周围淋巴鞘增厚情况减轻，提示在IgAN发病中，大鼠脾脏内体液免疫应答和细胞免疫应答增强。血液中IgA主要由骨髓中的浆细胞产生，分泌型IgA主要是由胃肠道和呼吸道黏膜免疫系统产生。本研究考虑IgA主要由B细胞激活后分泌，而脾脏是B细胞的主要定居地及免疫应答的主要场所，结合病理观察实验结果，与对照组相比，IgAN组大鼠脾脏白髓中脾小体增大增多，生发中心明显（脾小体内主要为B细胞），推测IgAN中大量产生的IgA与脾脏B细胞增殖有关，RAPA和AS可抑制免疫激活，减轻免疫应答。

调节性B细胞（regulatory B cells，Breg）在2006年首次被发现，是B细胞的亚群，主要通过分泌IL‐10及TGF‐β等免疫抑制因子发挥免疫调节作用［10］。分泌IL‐10的Breg是目前研究热点，其可抑制小鼠过敏反应和部分自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、炎症性肠病、接触性过敏反应、哮喘、自身免疫性脑脊髓炎等［11］。本研究显示，与对照组相比，IgAN组大鼠脾内IL‐10分泌减少，与IgAN组相比，RAPA组和AS组大鼠脾内IL‐10分泌增多，提示免疫抑制因子IL‐10分泌减少，免疫应答过度激活，可能是引起IgAN发病的重要原因，分泌IL‐10的调节性淋巴细胞是IgAN发病的关键。RAPA和AS可促进IL‐10分泌，抑制过度免疫应答，可能是导致其肾小球系膜区IgA沉积减少的原因之一。同时，本研究显示，与对照组相比，IgAN组大鼠脾内CD4+T细胞增加而CD8+T细胞减少，与IgAN组相比，RAPA组和AS组大鼠脾内CD4+T细胞减少而CD8+T细胞增加，提示在IgAN大鼠脾内Th增多而Ts减少，发生免疫系统过度激活，AS和RAPA均可有效纠正这种免疫失衡，抑制免疫系统过度激活，进一步说明调节性淋巴细胞对IgAN发病起重要作用。

文献报道，mTOR（雷帕霉素靶蛋白）在炎症性自身免疫性疾病中发挥重要作用，在IgAN中的作用前言中也有报道［12］。mTOR信号通路对调节Breg、T细胞、单核细胞、中性粒细胞和树突状细胞分化具有重要作用，mTOR分为mTOR复合物1（mTORC1）和mTOR复合物2（mTORC2）2种，mTORC1对RAPA及其衍生物敏感，雷帕霉素可抑制淋巴细胞增殖，mTOR与淋巴细胞分化成熟密切相关［13‐15］。ZHANG等［16］构建了含有mTOR亚等位基因的小鼠模型，下调mTORC1和mTORC2活性及mTOR蛋白表达，小鼠前体B细胞早期发育被部分阻断，外周B淋巴细胞数明显减少。在B细胞受体（BCR）介导的B细胞激活中，无论是RAPA还是磷脂酰肌醇‐3‐激酶（PI3K）抑制剂均可阻断B淋巴细胞增殖，提示PI3K及下游mTOR直接影响BCR通路［17］。mTORC1信号被激活后，作用于转录因子核糖体蛋白激酶（p70S6k）和4E‐结合蛋白1（4E‐BP1），其磷酸化程度是反映mTORC1活性的重要指标，在下游蛋白翻译过程中起关键作用。p70S6k被mTORC1激活后可促进mRNA翻译。本研究显示，IgAN大鼠脾内p‐mTOR和p‐p70S6k表达上升，与IgAN组相比，RAPA组和AS组大鼠脾内p‐mTOR和p‐p70S6k表达降低，提示在IgAN发病过程中，mTORC1信号通路被激活，而RAPA和AS可抑制mTORC1信号通路激活。基于对BCR增殖作用的影响，抑制mTORC1通路、调节淋巴细胞增殖和分化、抑制免疫炎症反应有望成为自身免疫性疾病治疗的有效方法。

AS是从中药黄芪中提取的中药单体，是黄芪的主要药理成分之一，可减少MCP‐1、TNF‐α和TGF‐β等炎症细胞因子分泌，减轻免疫炎症反应。利用免疫抑制剂治疗IgAN已取得一定疗效［18］。课题组前期研究发现，AS可有效地减少IgAN大鼠脾脏CD20+B细胞数，具体途径可能是AS通过抑制促炎症因子高迁移率族蛋白1（high mobility group pro-tein 1，HMFB1）抑制炎症反应，而HMFB1可通过调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）影响B细胞分化和增殖，纠正免疫失衡。本研究显示，与IgAN组相比，AS组大鼠脾内p‐mTOR和p‐p70S6k表达降低，mTORC1信号通路被抑制。RAPA可抑制B淋巴细胞增殖，mTOR与B淋巴细胞的分化成熟密切相关，推测AS可能通过抑制mTORC1通路减少脾脏内效应性B细胞数，从而减少IgA产生，减轻免疫炎症反应。

综上所述，AS可减轻IgAN大鼠肾小球系膜区IgA沉积，可能与抑制mTORC1信号通路，调节脾脏内淋巴细胞分化和增殖有关，是否有其他信号通路参与有待进一步研究。