酶联免疫吸附法在血清舒芬太尼血药浓度检测中的应用

游雅珊

(湖南省石门县人民医院,湖南 常德 415000)

舒芬太尼系临床常用麻醉药物，属阿片类受体激动剂，具有较高选择性及较强镇痛效果，在临床手术中得到广泛应用，但舒芬太尼血药浓度过高易导致患者出现呼吸抑制、心动过速、骨骼肌强直等不良反应，故在舒芬太尼用药期间实时监测患者血药浓度尤为关键[1]。气相色谱法等舒芬太尼血药浓度检测的几种方法多存在检测条件要求高、检测速度慢、重复性差等不足，致使难以在第一时间明确患者舒芬太尼血药浓度，进而无法得到实时药物效果[2]。故本次研究将酶联免疫吸附法应用于人血清舒芬太尼血药浓度检测，并对其应用价值进行研究分析，现报道如下。

1 材料

1.1 仪器

酶标仪(型号：ST-360，厂家：上海寰熙医疗器械有限公司)，超低温冰箱(型号：BDF-86V158，厂家：济南来宝医疗器械有限公司)，单道移液器(型号：Research plus，厂家：德国艾本德股份公司)，超纯水机(型号：JC-PCDX-J-40，厂家：上海景纯水处理技术有限公司)等。

1.2 试剂

人舒芬太尼ELISA检测试剂盒(规格：96T，厂家：上海继锦化学科技有限公司)，舒芬太尼注射液及对照品(规格：2mL : 100μg，批准文号：国药准字H20054171，厂家：宜昌人福药业有限责任公司)，异丙酚(规格：20mL : 0.2g，批准文号：国药准字H20123138，厂家：江苏恩华药业股份有限公司)[3]，阿托品(规格：1mL : 0.5mg，批准文号：H12020382，厂家：天津金耀药业有限公司)，氟哌利多(规格：2mL : 5mg，批准文号：国药准字H31020895，厂家：上海旭东海普药业有限公司)，空白人血清(厂家：北京汇智和源生物技术有限公司)，盐酸溶液(规格：1mol/L，厂家：济南斯维尔实验器材有限公司)，超纯水(实验室超纯水机制备)，去离子水(实验室超纯水机制备)。

1.3 对照品溶液配制

利用去离子水将舒芬太尼对照品分别配制出浓度为1mg/L和10μg/L的舒芬太尼对照品溶液。

1.4 检测方法

严格参照人舒芬太尼ELISA检测试剂盒说明操作，选用测定稀释液对酶标、舒芬太尼及清洗液行稀释处理，移液器精准吸取待测样品至合适孔中，另加入药酶结合物180μL，室温下孵育45min。待将微板拍干，向孔中注入清洗液300μL，共行3次手动清洗处理[2]。清洗结束后向孔中加入显色剂150μL，选用振荡器对微板行轻微震荡处理，确定显色剂混匀后室温下孵育30min。孔中加入1mol/L盐酸溶液50μL将反应终止，另选用酶标仪进行读板，酶标仪波长设置为450nm[4]。

1.5 统计学方法

选用Medcalc(V20.0.3)软件处理分析数据，以均数±标准差表示计量资料，执行独立样本t检验。

2 方法与结果

2.1 绘制标准曲线

选用空白人血清将舒芬太尼及其对照品分别配制成浓度0.050、0.100、0.200、0.400、0.750、1.000和1.500μg/L溶液，应用酶联免疫吸附法测定各浓度溶液吸光度，并以溶液浓度为横坐标[5]，吸光度为纵坐标，以半对数模型拟合绘制标准曲线，计算检测限。经测定计算，获得舒芬太尼标准曲线(Y=-0.512lnχ+0.696，R2=0.999)和舒芬太尼对照品标准曲线(Y=-0.578lnχ+0.718，R2=0.994)，两标准曲线在0.050～1.500μg/L浓度内线性关系良好，检测限为0.050μg/L。

2.2 精密度实验

选取空白人血清配制浓度为0.050、0.100、0.250、0.500、0.750、1.000、1.250和1.500μg/L舒芬太尼溶液进行精密度实验，每个浓度各行6次测定，分别计算日内精密度和日间精密度。结果显示，日内与日间精密度RSD值分别为0.47%～5.70%和1.54%～8.15%，表明该方法准确性良好。见表1。

表1 精密度实验结果(n=6)

2.3 回收率实验

同选空白人血清配制浓度为0.050、0.100、0.250、0.500、0.750、1.000、1.250和1.500μg/L舒芬太尼溶液进行回收率实验，每个浓度各行6次测定，计算平均回收率。结果显示，平均回收率为96.67%～101.20%，RSD值为0.64%～4.97%，表明该方法重复性良好。见表2。

表2 回收率实验结果

2.4 干扰实验

应用酶联免疫吸附法分别对异丙酚、阿托品、氟哌利多与抗舒芬太尼抗体的结合物进行检测，如果受检麻醉药物浓度达到10mg/L以上时依然未发生明显反应，则可将其视为交叉反应率<0.01%。结果显示，以上三种麻醉药物与抗舒芬太尼抗体交叉反应率均<0.01%，表明该方法检测结果不易受其他麻醉药物影响，抗干扰性良好。

2.5 样本检测

随机抽取我院行舒芬太尼麻醉手术患者40例，收集40分血清作为实验样本，结果显示样本血清舒芬太尼血药浓度为0.062～0.957μg/L，呈现对数正态分布。

3 讨论

随科学技术快速发展，以及医学技术的不断进步，越来越多的理想型麻醉药物相继问世，舒芬太尼、布托啡诺、瑞芬太尼等一系列高效麻醉药物的出现，让更多伴疼痛症状或手术患者真正感受到无痛、舒适与安全[6]。但无论是多么安全的麻醉药物，过量使用均会对患者呼吸系统、神经系统等造成损害，严重时还有可能导致患者死亡，对其生命安全造成威胁[7]。研究认为[8]，针对有效浓度与中毒血浓度较为接近的药物，为预防体内浓度过高而产生毒副作用，应积极开展定期血药浓度检测工作，其对于避免患者生命健康遭受侵害具有重要意义。另有研究指出[9]，通过开展血药浓度监测，不仅可避免用药过量的情况发生，还可确保药物浓度一直维持在有效范围内，从而有效提高治疗效果。故针对舒芬太尼用药患者，采取快速、精确、低成本的方式对其血药浓度进行实时检测显得尤为重要。

现阶段，用于检测人体舒芬太尼血药浓度的方法众多，高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法、反相高效液相色谱法等均可实现人体舒芬太尼血药浓度的有效检测，但受检测难度大、流程复杂、检测成本高等因素影响，以上几种检测方式无法实现临床普及，特别是技术水平有限的基层医疗机构[10]。酶联免疫吸附法是一种将可溶性抗原或抗体于固相载体，基于抗原抗体特异性结合行免疫反应的定性定量检测法，相比其他检测方法，酶联免疫吸附法检测效率高，且不会对环境造成污染[11]。检测过程中遵循竞争法原理，通过抗舒芬太尼抗体在辣根过氧化物酶、四甲基联苯胺及重水作用下发生显色反应，以实现舒芬太尼血药浓度的检测[12]。本次研究，酶联免疫吸附法可准确检测出舒芬太尼血药浓度，获得舒芬太尼标准曲线在0.050～1.500μg/L浓度内具有良好线性关系；精密度实验结果显示，该方法日内与日间的精密度RSD值可达0.47%～5.70%和1.54%～8.15%，提示酶联免疫吸附法在血清舒芬太尼血药浓度检测中具有极好的检测精确度；通过开展6次包括7个浓度梯度回收率实验，表2结果显示，利用该法进行舒芬太尼血药浓度检测，其平均回收率可达96.67%～101.20%，RSD值则低至0.64%～4.97%，提示酶联免疫吸附法在血清舒芬太尼血药浓度检测中具有较强的重复性，且通过干扰实验得知该法抗干扰性优异，说明该方法适用于舒芬太尼临床药动学研究与血药浓度监测。

综上所述，将酶联免疫吸附法应用于血清舒芬太尼血药浓度的检验当中，检验精确度、重复性较高，抗干扰能力较强，操作简单、便捷，检测速度快，且不会对外界环境造成过多污染。