阿托伐他汀对实验性大鼠脑出血后神经功能保护的研究

张岚，贺武斌，孔亚男，钟倩，于欢

(1.锦州医科大学附属第一医院；2.锦州医科大学护理学院，辽宁 锦州 121000)

脑出血是严重的脑卒中疾病，患者死亡率高、预后差。临床治疗脑出血一般采取调脂、降压、降糖、补充脑营养等保守治疗方法，但疗效和预后的改观均不明显[1-2]。脑水肿是脑出血患者的常见合并症之一，也是引发神经功能缺损、促使脑出血加重的首要因素，水通道蛋白4(AQP-4)参与脑组织细胞的水分子转膜，与脑水肿的发生密切先关，在脑出血发生后，AQP-4的表达水平显著增加，用以清除胞间多余水分、维持脑细胞水平衡[3-4]。阿托伐他汀是一种常用的羟甲基戊二酸单酰辅酶还原酶抑制剂，具有调脂、抗炎、修复血管内皮和促进脑神经新生的作用，还有研究提示阿托伐他汀能够下调APQ-4并因此起到抗脑水肿的治疗效果，为了探讨阿托伐他汀对于脑出血的疗效、神经功能、脑组织形态学和脑水量的影响，进一步分析阿托伐他汀与APQ-4表达的关系和作用机制，特进行本次动物实验。

1 资料和方法

1.1 实验对象

选取SD大鼠共120只，雌雄各60只，由中科院动物研究所提供，体重250～300 g，在我院动物实验中心饲养，饲养用饲料购自由上海帆泊生物，SD大鼠饮用水为自来水，温度(20～25)℃，每天光照时间为12 h，饲养室湿度40%～80%，每日清洁饲养笼、更换垫料，饲养1 w，待大鼠适应环境后，剔除生病、死亡大鼠并进行相关动物实验。

向大鼠腹腔注射麻醉药物，向颅内注射自体血构建脑出血SD大鼠模型，从存活大鼠中以脑出血动物行为学分级结果选择脑出血分级1～3级SD大鼠，根据性别分层随机抽样选择80只SD大鼠(雌雄各半)作为造模成功的最终实验对象。将80只SD大鼠随机分为治疗组和对照组，每组40只，治疗组给予10 mg/kg阿托伐他汀进行灌胃治疗，对照组注射等量无菌生理盐水，两组以给药前24 h、给药后96 h作为观察点分配SD大鼠，见表1。

表1 两组不同观察点的SD大鼠分配情况统计(只)

1.2 试剂和仪器

试剂：3.5%水合氯醛(武汉博莱特化工)、阿托伐他汀钙片(国药准字：H20051407；生产厂家：辉瑞制药有限公司；规格：10 mg×7 s)、AQP-4 Elisa检测试剂盒(臻科生物)、苏木精伊红染色液(广州艺得诺生物科技有限公司)；PBS溶液、二甲苯、0.9%生理盐水、梯度酒精、3%H2O2、甲醛溶液均在我院病理科配制。

仪器：2CA-320M数字摄像生物显微镜(上海光学仪器厂)、BS210S电子天平(德国赛多利斯)、微量溶液进样器(北京英伟达科技有限公司)、恒温干燥箱(上海精若科学仪器有限公司)、鼠脑立体定位仪(西南医科大学中心实验室)、Image-Pro-Plus 6.0图像分析系统、相关手术器械由我院提供。

1.3 方法

1.3.1 脑出血SD大鼠造模手术 本研究采用自体血颅内注入术制作脑出血SD大鼠模型，用于造模的120只大鼠在术前均禁饮食8 h以上，称重后向大鼠腹腔注射0.01 mL/g剂量的3.5%水合氯醛进行麻醉，麻醉完全后，取仰卧位，大鼠头颅置于鼠脑立体定位仪，固定大鼠牙齿、耳道，使其前囟、后囟保持正中水平。剃颅顶毛，消毒铺巾，在两耳连线正中行2 cm垂直切口，完全暴露颅骨，加30%双氧水腐蚀筋膜后，在前囟前0.2 mm、前囟、后囟连线中线后3 mm以牙钻垂直小心地钻1 mm圆孔，至硬脑膜前停止。用40 ℃温水浸泡大鼠尾部2 min，待变软后拭干，酒精表面消毒后断尾取血50 μL，利用微量进样器沿圆孔垂直进针5～6 mm，以20 μL/min滴速注入自体鼠尾血10 μL，观察大鼠应激情况，若无异常再用相同的方式注射完剩余40 μL自体血，注射后留针5 min，缓慢退针以免伤及脑部，约2 min完成退针。以骨蜡封鼠尾和针口，手术部位均用碘伏消毒、缝合，麻醉苏醒前观察大鼠生命体征，苏醒后，从存活大鼠中以脑出血动物行为学分级结果选择脑出血分级1～3级SD大鼠，根据性别分层随机抽样选择取80只SD大鼠(雌雄各半)作为造模成功的最终实验对象并回笼饲养。

1.3.2 给药方法 在上述观察时间点对各组实验对象进行神经功能评价和脑组织摘除手术后处死，治疗组给予10 mg/kg阿托伐他汀灌胃，对照组注射等量无菌生理盐水，第一次给药后每24 h给药1次。

1.3.3 BWC的测定 在各观察点神经功能评估结束后对各组大鼠进行麻醉，麻醉剂为3.5%水合氯醛，大鼠意识完全丧失后，立即离断头颈部，开颅并取出脑组织，仔细探查造模时注入自体血的针眼区域，以针眼为中心做纵切将脑组织分为前、后两个部分，取前脑组织置于安瓿瓶用电子天平，通过差值法计算前脑组织湿重N1；称重后将前脑组织置于恒温干燥箱中以(80～100)℃温度烘烤24 h后取出，通过差值法计算脑组织干重N2，差值=NT-N0(N0为安瓿瓶空瓶重量)。BWC=(N1-N2)/N1×100%。称重完成后，将剩余的脑组织置于甲醛溶液中加以固定，选取针眼附近出血灶进行切片、HE染色，并对切片进行AQP-4免疫组化检测。

1.3.4 APQ-4表达免疫组化检测 将剩余脑组织制成石蜡切片后送至病理科按照APQ-4 Elisa检测试剂盒操作要求进行免疫组化检测，首先对样本进行脱蜡处理，并加入3%H2O2孵育20 min，用蒸馏水洗净后置于摇床，加入PBS溶液浸泡5 min，加入封闭液山羊血清孵育5 min，吸去液体，用PBS溶液反复清洗3次，每次5 min。加入一抗兔抗鼠APQ-4，稀释比例1∶100，37 ℃孵育30 min后用PBS溶液清洗3次，每次5 min，加入二抗辣根过氧化物酶底物，37 ℃孵育2 h后漂洗3次，每次5 min。加入显色剂DAB，显色后用苏木精伊红染液复染约10 s，后进行脱水、透明处理，封片后置于生物显微镜下观察颜色并捕捉影像，染色后，APQ-4表达为阳性的细胞细胞核应呈棕褐色，随机选取整个切片的5个视野摄像，用Image-Pro-Plus 6.0图像分析软件处理图像，规定APQ-4阴性表达细胞吸光度为零，计算整体细胞的吸光度值(OD)并取平均值，OD越高，表明APQ-4阳性表达率越高。

1.4 评估标准

1.4.1 动物脑出血分级标准 在取自体血注射SD大鼠颅内完成脑出血造模后约2 h，待大鼠苏醒后动物行为根据动物行为学特征对大鼠的脑出血严重程度进行评级，标准为：0级，大鼠神经及动作行为均正常；1级，不能灵活、完全地伸展对侧前爪；2级，瘫痪侧转圈、追尾状；3级，爬行时向对侧倾倒或不能走路、意识丧失。造模后选取1～3级脑出血SD大鼠，饲养1 w后剔除死亡大鼠，根据性别分层抽样选取80只脑出血SD大鼠造模成功并分组实验。

1.4.2 大鼠神经功能缺失评分标准 在给药前第24 h、给药后第96 h对两组SD大鼠的神经功能缺失程度进行评分，采用Masao Shmi izu-Sasamata标准：(1)自主活动受限情况；(2)左前肢偏瘫情况；(3)提尾时左前肢伸情况；(4)抗侧推能力；(5)爬行时左倾斜度；(6)向左环行度；(7)触须反应，根据上述条目大鼠神经缺损程度每项计0分(正常)、1分(中等异常)、2分(严重异常)，神经功能缺失评分总分0～14分，评分越高，表明大鼠神经功能缺损越严重。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 给药前后两组SD大鼠的神经功能缺损程度分析

给药前24 h，两组SD大鼠的神经功能缺损程度评分比较差异无统计学意义(P>0.05)，给药后96 h，治疗组神经功能缺损评分较给药前显著降低(P<0.05)，对照组神经功能缺损评分较给药前无显著变化(P>0.05)，给药后治疗组SD大鼠的神经功能缺损评分也明显低于对照组(P<0.05)，见表2。

表2 给药前后两组SD比较(分)

2.2 给药前后两组SD大鼠的BWC分析

给药前24 h，两组SD大鼠的BWC数值比较差异无统计学意义(P>0.05)，给药后96 h，治疗组BWC数值较给药前显著降低(P<0.05)，对照组BWC数值较给药前无显著变化(P>0.05)，给药后治疗组SD大鼠的BWC数值也明显低于对照组(P<0.05)，见表3。

表3 给药前后两组SD大鼠的BWC数值比较

2.3 给药前后两组SD大鼠的APQ-4表达情况

给药前24 h，两组SD大鼠的APQ-4阳性表达值均高于正常水平，比较差异无统计学意义(P>0.05)，给药后96 h，治疗组APQ-4阳性表达值均较给药前显著降低(P<0.05)，但给药后治疗组SD大鼠的APQ-4阳性表达值显著低于对照组(P<0.01)，见表4，给药前后显微镜下两组SD大鼠脑组织免疫组化APQ-4表达情况，见图1。

表4 给药前后两组SD大鼠的APQ-4阳性表达光密度值比较

2.4 给药前后两组SD大鼠的出血灶组织形态学分析

光学显微镜下，给药前，两组大鼠脑组织可见红细胞聚集、明显水肿伴随炎性浸润，出血灶面积、最大径差异无统计学意义(P>0.05)，给药后96 h，治疗组出血灶面积、炎症浸润均明显减少，血肿灶组织形态学改善情况优于对照组，见图2。

3 讨 论

脑出血是指在未出现脑外伤情况下脑内血管破裂引发的颅内出血疾病，在脑卒中患者中的发病率为20%～30%，相较于缺血性脑卒中(脑栓塞)而言，脑出血虽发病率较低，但患者在急性期的死亡率更高，可达到30%～50%[5-6]，在恢复期则有80%以上的患者伴随神经功能缺损和障碍。

目前，开颅手术是治疗脑出血的有效手段，但开颅手术具有较高风险，因手术造成的死亡率高达30%[7]，对于老年患者一般采取调脂、降压、降糖、补充脑营养等药物治疗方法[8-9]。大量动物实验和临床数据表明[10-12]，脑出血患者的血管内皮细胞出现坏死后，与其相邻的脑组织细胞和内皮细胞的连接出现空隙，导致膜渗透压改变、水分子转膜出现障碍，这也使脑水肿严重程度与脑出血患者的预后出现了相关性联系，即脑水肿面积越大，患者死亡率、致残率越高，此外，脑水肿还能引发出血灶周边的炎性浸润和二次血管破裂和损伤，因此，减轻血管源性脑水肿是临床治疗脑出血的首要要求[13]。

水通道蛋白4(AQP-4)广泛分布于脑组织、内皮血管、蛛网膜下腔，参与脑组织细胞的水分子转膜活动，具有清除胞间多余水分、维持脑细胞水平衡的重要作用，在脑出血时，AQP-4的表达出现显著上调，且其表达水平与脑出血严重程度具有高度相关性，即出血灶越大、水肿面积越大，APQ-4表达水平越高。阿托伐他汀作为羟甲基戊二酸单酰辅酶还原酶抑制剂，具有抑制胆固醇合成、抗自由基氧化、抗炎、促进神经功能修复等作用[14]，本文以脑出血SD大鼠模型为研究对象，通过分组给药、比较不同观察点大鼠的神经功能缺损程度、出血灶四周组织形态学特点、BWC和AQP-4表达水平，探讨了阿托伐他汀在消除脑水肿、重建脑组织神经功能方面的积极作用，也试分析了阿托伐他汀对APQ-4代谢表达的调控关系和可能作用机制。

涂鄂文等的动物实验[15]结果提示，10 mg/kg剂量的阿托伐他汀对脑出血大鼠的神经功能的保护作用、脑水肿及出血灶组织形态学的改善水平最优，本研究也采用该剂量进行给药。研究结果与涂鄂文等的研究结果具有一致性：即对脑出血SD大鼠模型给予阿托伐他汀可显著改善大鼠神经功能缺失水平、减轻BWC及脑水肿、减少出血灶和炎性浸润灶，这也与阿托伐他汀能够下调基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)、AQP-4表达水平，上调基质金属蛋白酶抑制物-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)表达水平有关。此外，本研究还着重探讨了阿托伐他汀对AQP-4表达的影响，研究结果显示，给药后96 h，与给药前相比，治疗组大鼠脑组织切片中的AQP-4阳性表达光度值显著降低，同时少于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。经分析，阿托伐他汀可能参与脑组织水分子转膜过程的下述途径：(1)平衡胶质细胞参与的钠钾泵，疏通水分子通道、缓解脑水肿、消除血脑屏障；(2)抑制蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的磷酸化作用，保护脑组织神经功能；(3)抑制细胞膜去极化造成的钙超载，减轻血管内皮再灌注损伤。

综上所述，将阿托伐他汀应用于实验性大鼠的脑出血模型的治疗中对于大鼠神经缺损情况、脑水肿、出血灶面积和AQP-4的表达均具有明显的改善作用，值得进一步进行临床试验研究。