SPAG9在膀胱癌细胞表达及其对膀胱癌细胞增殖凋亡的影响①

王 博，罗 斌，贠艳艳

(1.洛阳市第一人民医院泌尿外科，河南 洛阳 471000;2.洛阳市第一人民医院NMICU，河南 洛阳 471000)

膀胱癌是一种常见的发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是人体常见的十大肿瘤之一。在我国，膀胱癌已经成为泌尿生殖系统恶性肿瘤发病率高居第一位的疾病[1]。膀胱癌发病人群广泛，可发生于任何年龄段的人群，甚至儿童也会发病，其发病率随着年龄的增长而提高，高发病人群主要集中在50～80岁，其中男性发病率是女性的4倍左右。其常见症状是上尿路阻塞、排尿困难、膀胱刺激症、血尿等。目前，主要治疗手段是膀胱切除术、放疗和化疗等，但是患者治疗和预后效果仍不佳。部分研究人员研究发现，精子相关抗原9(Sperm-associated antigen 9，SPAG9)在正常人体中曲细精管精子表达具有特异性[2]。SPAG9是一种最近几年研究发现的肿瘤睾丸抗原，其主要参与调节再生过程中细胞信号的传导。研究表明，SPAG9在肺癌、宫颈癌、乳腺癌等恶性肿瘤血清或组织中异常表达，这表明，SPAG9可能与恶性肿瘤的发生、发展、侵袭、转移密切相关[3]。但是鲜有对SPAG9在膀胱癌细胞表达情况和作用机制进行研究，本次研究采用平行实验，主要检测SPAG9在膀胱癌患者肿瘤细胞中的表达情况，重点观察研究肿瘤细胞的增殖凋亡，为全面了解和治疗膀胱癌提供新的依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2018-06～2019-12本院接诊治疗的126例膀胱癌患者为研究对象，年龄40～75岁，平均(64.32±7.81)岁。本研究经本院伦理委员会审理批准。纳入标准：膀胱癌患者[4]；无精神病者；患者未患有肾衰竭等疾病；同意参加本次研究；入本院之前未进行其他治疗；无过敏体质者。排除标准：病历资料不全者；中途退出研究的；放弃治疗者；无法参与研究的。

1.2 研究方法

采集患者RT4、J28、T24膀胱癌细胞系和膀胱上皮细胞SV-HUC-1。RT4细胞放置于常州德烨化工有限公司生产的含体积分数10%胎牛血清的Gibco mccoy's 5a 培养基培养。J28、T24细胞置于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基培养。SV-HUC-1置于美岚实业(上海)有限公司生产的F12K培养基培养。所有培养基均放置于上海知闵仪器设备有限公司生产的培养箱中，设置温度37℃，二氧化碳浓度为5%，培养过程中收集对数期细胞。

采用定量即时聚合酶链锁反应法检测SPAG9 mRNA表达：SPAG9下游引物5’-TAAGTTGATGACCCATTATTAACCA-3’，上游引物5’-ATGTCCATAATTATATGGAACATTTA-3’，β-actin下游引物5’-GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3’，上游引物5’-CCTCGCCTTTGCCGATC-3’。每孔细胞中加入浙江康德药业集团有限公司生产的TRIZOL总RNA抽提试剂，然后放置于冰上5min，即可提取总RNA。提取总RNA5μg，在65℃条件下冰浴3min，变性10min，使用美岚实业(上海)有限公司生产的反转录试剂盒说明合成cDNA，-20℃保存。使用常州德烨化工有限公司生产的宝生物染料法荧光定量试剂盒以反转录得到的cDNA为模板，参照β-actin，在94℃条件下预变性4min，94℃条件下变性30s，56℃条件下变性30s，72℃条件下变性30s，循环40个，重复3次。使用2-△△Ct法计算SPAG9的相对表达量。

采用Western blot法检测SPAG9蛋白表达水平：将培养基弃去，加入江苏方强制药厂有限责任公司生产的蛋白裂解液，5min冰浴，离心后得到上清液，提取2μL测定其浓度。剩余蛋白样品加入福建古田药业有限公司生产的5*蛋白上样缓冲液，煮沸5min，提取40μg样品置于上样孔中，设置压力为80V，电泳，然后调整压力为120V，在300mA条件下转膜150min，将聚偏氟乙烯膜置于5%浓度的奶粉溶液中，孵育2h，加入吉林省康钰药业有限公司生产的一抗，在4℃条件下孵育，漂洗后加入超敏ECL化学发光液，使用上海修远仪器仪表有限公司生产的凝胶成像仪进行分析，使用BCA蛋白浓度检测法测定蛋白质灰度值。

将T24细胞稳定传代后转染。将该细胞分为3组：siRNA-SPAG9组(正常转染)、转染无义组(转染失败)和对照组(不作处理)。转染开始前1d，每孔3×105个细胞，转染开始前6h将培养基更换为无血清培养基。将siRNA放置于无血培养基，室温条件下孵育10min，每孔均加入孵育后复合物，37℃条件下孵育6h，然后使用完全培养基培养，使用Western blot法和定量即时聚合酶链锁反应法检测SPAG9表达情况。

MTT比色法检测细胞增殖：每孔接种5×103个细胞，转染，使用上海修远仪器仪表有限公司生产的培养箱培养2d，加入MTT20μL，在37℃条件下培养4h，弃去上清液，加入二甲基亚砜100μL，在避光条件下振荡20min，记录细胞490nm时的吸光值。

采用流式细胞术检测细胞凋亡率：转染2d后，使用西安立邦制药有限公司生产的无菌磷酸盐清洗，浓度调整为1×105/mL，加入缓冲液，培养孔加入Annexin V5μL，在室温条件下孵育15min，然后加入碘化丙啶5μL，使用南京大学普阳科学仪器研究所生产的流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3 观察指标

记录RT4、J28、T24膀胱癌细胞系和膀胱上皮细胞SV-HUC-1中SPAG9mRNA及蛋白表达情况、转染后T24细胞SPAG9表达情况、细胞490nm时的吸光值和细胞凋亡率。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 SPAG9表达情况

RT4、J28、T24细胞中SPAG9 mRNA及蛋白表达均高于SV-HUC-1细胞，差异有统计学意义(P<0.05)，RT4、J28细胞中SPAG9 mRNA及蛋白表达均低于T24细胞，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 SPAG9表达情况分析

siRNA-SPAG9组、转染无义组和对照组细胞中SPAG9 mRNA及蛋白表达水平差异有统计学意义(P<0.05)，且siRNA-SPAG9组明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 转染后T24细胞中SPAG9表达情况分析

2.3 膀胱癌细胞增殖结果分析

siRNA-SPAG9组(n=42)、转染无义组(n=42)和对照组(n=42)细胞490nm吸光值分别为0.56±0.03、1.26±0.22、1.23±0.12，整体比较差异有统计学意义(F=14.116，P=0.005)，siRNA-SPAG9组明显低于对照组，差异有统计学意义(t=6.537，P=0.011)。

2.4 膀胱癌细胞凋亡结果分析

siRNA-SPAG9组(n=42)、转染无义组(n=42)和对照组(n=42)细胞凋亡率分别为(17.89±2.13)%、(5.86±0.71)%、(6.25±0.74)%，整体比较差异有统计学意义(F=49.031，P=0.000)，siRNA-SPAG9组明显高于对照组，差异有统计学意义(t=8.351，P=0.007)，见图1。

图1 膀胱癌细胞凋亡结果分析

3 讨论

据研究人员统计，膀胱癌手术治疗后往往发生转移，5年生存率较低，手术及放化疗费用高，给患者及其家庭带来巨大的心理压力和经济压力[5]。所以找到一种治疗膀胱癌的靶向物质，能够使医护人员更好的了解治疗膀胱癌显得尤为重要。SPAG9是目前人们用来研究膀胱癌的较为有效的一种抗原，在肿瘤细胞的增殖和癌基因的表达调控方面有重要作用[6]。早期研究人员认为，SPAG9只表达于人体睾丸组织细胞中，在人体正常组织中无表达[7]。随着科学技术的不断发展和医学研究的深入，人们发现，SPAG9在恶性肿瘤患者血清和肿瘤组织中发挥着重要的免疫作用[8]。鉴于膀胱癌在我国患病人群数量巨大、发病率高、治疗难度大，所以更应加大SPAG9在膀胱癌细胞表达情况以及与细胞增殖凋亡的关系研究，早日找到治疗膀胱癌的方法[9]。

研究发现，SPAG9能够与人体内多种蛋白和细胞因子结合，可以激活细胞中大量的信号通路，参与人体多项生理活动，与人体部分器官和脏器疾病的发生，特别是恶性肿瘤的增殖凋亡关系密切[10]。所以，SPAG9极有可能是一种在恶性肿瘤治疗方面具有重要作用的生物靶点。本次研究发现，RT4、J28、T24细胞中SPAG9 mRNA及蛋白表达均高于SV-HUC-1细胞，RT4、J28细胞中SPAG9 mRNA及蛋白表达均低于T24细胞，这表明SPAG9表达水平不同与膀胱癌疾病的发展程度有着重要的关系。大量研究表明，研究肿瘤细胞的增殖凋亡对提高治疗效果，降低患者治疗费用有重要作用。恶性肿瘤细胞的增殖是肿瘤疾病发展的重要标记。多种细胞通路和细胞因子与肿瘤细胞增殖关系密切。本次研究发现，siRNA-SPAG9组、转染无义组和对照组细胞中SPAG9 mRNA及蛋白表达水平差异有统计学意义，且siRNA-SPAG9组明显低于对照组，这表明SPAG9在膀胱癌疾病诊断中发挥重要的生物学特性作用。大量研究人员研究发现，SPAG9与除了膀胱癌之外的众多恶性肿瘤细胞的增殖和凋亡有重要关系。SPAG9在肺癌血清及组织中异常表达可以作为诊断肺癌的重要手段。本次研究发现，siRNA-SPAG9组、转染无义组和对照组细胞490nm吸光值整体比较差异有统计学意义，siRNA-SPAG9组明显低于对照组，siRNA-SPAG9组、转染无义组和对照组细胞凋亡率整体比较差异有统计学意义，siRNA-SPAG9组明显高于对照组，这和部分人员的研究结果基本一致[11]。这说明，SPAG9可以调控膀胱癌肿瘤细胞的增殖和凋亡，这对于治疗膀胱癌具有重大意义。

综上所述，SPAG9 mRNA及蛋白在膀胱癌细胞中高水平表达，与膀胱癌细胞增殖凋亡密切相关，但是本次研究结果有局限性，参与研究患者数量少，所以尚需进一步研究。