LYZL6在正常男性和弱精子症患者精液精子中的表达①

张小悦，蔡华戈，曾繁飞，杨伟忠

(惠州市第三人民医院泌尿外科， 广东 惠州 516000)

不孕不育症在临床上较为常见，会对人类的身心健康构成较大的危害。WHO相关调查数据显示，目前全球范围内育龄夫妇中，不孕不育症夫妇占到了其中的1/5，并且男、女因素约各占50%[1]。在不育症中，男性因素较为复杂，其诱发因素诸多，常见的如遗传、环境、感染、免疫等。近年来，随着生态环境污染的加重，人们生活方式的改变，男性精液质量不断下降，男性不育患者数量逐渐增加，极大地降低了人类的生育水平。相较于无精症、少精症引发的男性不育，弱精子症引起男性不育更为常见，占比最大[2]。 LYZL6(lysozyme-like 6)基因属于溶菌酶类似蛋白(Lysozyme-like proteins，LYZLs)中的一种，既往动物实验提示其在精子发生的过程中发挥重要作用，其可能与精子活力相关。因此，通过对LYZL6基因在正常男性及弱精子症患者精液精子的表达差异研究，可揭示LYZL6基因与精子活力的关系，可为弱精子症的诊治提供新的思路。为此，本研究纳入我院收治的36例弱精子症患者和15例精液健康男性进行分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验试剂

RNA提取试剂盒All Prep DNA/RNA Mini Extraction kit(80204)购自 Qiagen。反转录试剂盒 Prime Script RT reagent Kit和荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex TaqTM II 均购自 Takara。LYZL6一抗(PA5-44117) 购自Thermo Fisher,内参GAPDH一抗 (AF0006)购自碧云天，HRP-羊抗兔IgG 二抗(31460)购自Thermo Fisher。

1.2 精液标本收集

选取我院2019-06～2020-06男科门诊诊治的患者进行研究。收集精液，精液采用全自动计算机辅助精液分析系统(CASA)对精液进行常规分析。弱精子组纳入标准：(1)精液常规精液中的前向运动精子总数(PR)<32%，反复检测3次并确诊；(2)年龄≥22周岁，已婚；(3)精神和认知正常，可完成基本的交流和沟通；(4)临床资料完善、齐全。排除标准：(1)感染所致弱精子症者；(2)合并心肝肾等器官功能障碍者；(3)合并精索静脉曲张曲张等；(4)其它传染性疾病者。另纳入同期接受检查健康的正常生育男性精液样本作为研究对象，视为对照组，所纳入者均已婚已育。精液标本收集前均充分告知患者并取得患者的知情同意，并得到惠州市第三人民医院伦理委员会的批准。

1.3 Percoll法分离精液纯化精子

采用文献报道[3]的1层法梯度离心法分离精子，并显微镜下确认纯化效果，分离纯化后的精子经PBS溶液洗涤2次后离心，储存于-80 ℃冰箱。

1.4 荧光定量PCR法检测

采用荧光定量PCR法检测LYZL6 mRNA表达：(1)采用 All Prep DNA/RNA Mini Extraction kit (80204，Qiagen，USA)提取精子总RNA，用20μL无RNase dd H2O溶解。(2)采用Nano Drop TM Spectrophotometers RNA浓度测定仪(Thermo Scientific，USA)，检测总RNA浓度、A260/A280及A230/260比率。(3)每例1μg RNA模板，应用Takara逆转录试剂盒(Prime Script RT reagent Kit)进行逆转录反应，反应体系为20μL。(4)用Takara SYBR Premix Ex TaqTM 罗氏480荧光定量PCR行qPCR，LYZL6 引物如表1。扩增条件：94℃5min; 94℃30s；65℃45s；72℃30s，30循环。采用2-△△Ct相对定量来检测LYZL6 mRNA在正常精液精子和弱精子症精液精子的表达差异。

表1 基因 RT-PCR 引物序列信息

1.5 Western blot检测

采用Western blot检测LYZL6蛋白表达：(1)精液标本加入适量蛋白裂解液，用超声细胞破碎仪进行超声裂解，样品置冰上3～5min，12000rpm离心20min，取上清置于管中，-80℃保存。(2)考马斯亮蓝法测定蛋白含量。(3)样品在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳，浓缩胶电压80V，分离胶电压120V。(4)使用电转移仪将样品转至 PVDF 膜上(400mA电流冰上电转移2h)。(5)将膜移至封闭液中封闭1h，TBST漂洗3次。(6)加入一抗，室温下作用1h，TBST漂洗3次。(7)加入二抗，室温下作用1h，TBST 漂洗3次。(8)辣根过氧化物酶-ECL 法显影。(9)凝胶图像系统分析目标条带的灰度值，以分子Marker确定目标条带分子量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 两组精液分析的主要参数比较

按以上纳入及排除标准，收集36例弱精子症患者精液标本及15例正常对照组精液标本，收集并分析两组间精液样本参数，发现两组样本在年龄、精液体积、精子浓度上没有统计学差异(P>0.05),但正常组中前向运动精子率、精子总活力、形态正常精子率均高于弱精子症组，具有统计学差异(P<0.01),见表2。

表2 两组精液分析的主要参数比较

2.2 两组LYZL6 mRNA表达的比较

经荧光定量PCR检测LYZL6 mRNA在精液中表达，发现LYZL6 mRNA在弱精子症患者和正常生育男性精液精子中均未见明显表达。

2.3 两组LYZL6 蛋白表达的比较

为进一步检测LYZL6蛋白在弱精子症患者及正常对照组的表达情况，采用Western blot技术检测了15例正常精子样本和35例弱精子症样本中LYZL6蛋白的表达水平。运用Image Lab图像分析软件进行灰度值分析，计算LYZL6蛋白的相对表达量，弱精子症组LYZL6蛋白表达与正常对照组相比，显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。见图1。

图1 LYZL6蛋白在正常对照组和弱精子症患者精子中的表达

3 讨论

男性弱精子症是男性不育常见原因，根据《WHO人类精液及精子-宫颈黏液相互作用实验室建议手册》，将前向运动精子百分率低于32%，诊断为弱精子症[4]。精子的顶体、尾部轴丝和纤维鞘的结构异常，都可能导致精子运动能力下降，进而导致弱精子症。精子的发生包括了精原细胞的自我更新、精母细胞的减数分裂和精子细胞的变态过程，在这些过程中存在着复杂的基因表达与调控，任一环节出现问题都会导致男性不育。目前对弱精子症的病因及发病机制不明。

研究发现，DNAH1、CRISP2、Ropporin等[5～7]基因与弱精子症的发生相关。 LYZL6基因属于溶菌酶类似蛋白中的一种。目前研究发现溶菌酶蛋白如(LYZL2、LYZL4、SPACA3)表达于雄性动物(如小鼠或人)的生殖系统，定位于精子上，参与受精过程。LYZL6蛋白为属于典型的C型溶菌酶, 是一种分泌蛋白，LYZL6蛋白表达于精子顶体后和后段及中段。在前期的动物实验中我们发现，Lyzl6基因在小鼠21d龄及之前的睾丸中没有表达，28d睾丸中开始持续高表达，Lyzl6 mRNA在14种小鼠组织中呈现睾丸显著高表达[8]。采用Western Blot法检测LYZL6 的表达情况进行了分析，在睾丸和附睾中检测到了LYZL6蛋白的分布，类似其他类溶菌酶蛋白在男性生殖系统中的特异性分布。既往研究发现LYZL6可能在受精过程中发挥重要作用，LYZL6基因表达可能与精子活力相关[9]。本研究收集男性精液标本，采用计算机辅助精液分析仪，根据 WHO 标准，筛选出正常精液标本及弱精子症标本。采用 Percoll 不连续梯度法分离精子，分离后的精子进行荧光定量PCR法、Western blot法等检测，通过对比分析弱精子症患者和正常生育男性精液中，LYZL6 mRNA表达和LYZL6蛋白发现，LYZL6 mRNA在弱精子症患者和正常生育男性精液精子中均未见明显表达，提示精子为分化成熟细胞，LYZL6 mRNA在精

子分化成熟后可能停止表达，精子中的LYZL6蛋白可能是由生精过程中精母细胞产生分泌后附着于精子。通过Western blot法比较LYZL6蛋白在弱精子症患者和正常组精子的表达发现弱精子症LYZL6蛋白表达均明显低于正常组(P<0.05)，提示了在弱精子症患者中，的确存在LYZL6蛋白 表达异常的现象。根据本实验结果，可以初步得出结论：LYZL6表达的异常，参与了弱精子症的形成过程，对男性不育产生了较大的影响。但由于临床关于相关方面的报道较少，再加上选取的样本数量不足，可能会对本研究的结果产生影响，因此需在日后进一步深入研究。

综上所述，LYZL6在弱精子症患者精液精子中存在低表达的现象，提示LYZL6蛋白可能其在弱精子症中扮演着非常重要的角色, LYZL6蛋白低表达可能是造成男性不育的因素之一，为揭示弱精子症的病因及其临床诊疗提供新思路。