宁夏春小麦种质资源Wx基因分子鉴定及其分布

亢 玲，李瑞博，王小亮，张维军，何进尚，陈东升

(1.宁夏农林科学院农作物研究所，宁夏银川 750004； 2.西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100)

颗粒结合淀粉合成酶(granule-bound starch synthese ,GBSS)是直链淀粉合成途径中的关键酶，又称为Waxy蛋白(简称Wx蛋白)。普通小麦(TriticumaestivumL.)Wx蛋白由Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1三个蛋白亚基组成，分别由位于7AS染色体上的Wx-A1基因、4AL染色体上的Wx-B1基因和7DS染色体上的Wx-D1基因所编码[1]。小麦淀粉由直链和支链淀粉两种类型组成，二者的含量与比例影响小麦淀粉的理化特性，最终决定小麦面粉的用途[2]。Wx蛋白亚基的缺失及组合类型不同，其直链淀粉含量存在明显差异。陈东升等[3]研究表明，Wx蛋白缺失类型对直链淀粉含量的效应依次为：Wx-Al、Wx-Bl和Wx-Dl全缺失>Wx-Bl和Wx-Dl缺失>Wx-Al和Wx-B1缺失>Wx-Al和Wx-Dl缺失>Wx-B1缺失≈Wx-Dl缺失>Wx-A1缺失。当3个Wx蛋白全部缺失时，直链淀粉含量接近于零，即为糯小麦。前人研究表明，不同Wx蛋白亚基缺失类型的小麦具有不同的加工用途，Wx-Bl亚基缺失的小麦品种，其直链淀粉含量为22.3%，更适合制作优质面条；Wx-Al、Wx-Bl和Wx-Dl亚基全缺失的小麦品种，其直链淀粉含量几乎为零，可形成全糯小麦，可做配粉满足不同面制品加工的需要，有利于制作速冻和冷冻食品，也会延长面包等制品的货架寿命[4-7]。因此，分析和鉴定Wx基因在宁夏春小麦种质资源中的分布规律，对选育和改良优质面条小麦品种具有重要意义。

宁夏是我国春小麦生产的重要地区之一，面条是宁夏传统主食之一。近年来，宁夏育种者主要以小麦产量和蛋白品质为研究重点，而对小麦的淀粉品质研究较少，对宁夏春小麦种质资源中Wx等位基因的变异与分布情况还不清楚。因此，本研究利用已开发的Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1基因分子标记，对宁夏春小麦种质资源淀粉品质基因Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1进行鉴定和评价，了解其变异类型和分布状况，筛选Wx基因缺失的种质资源，以期为该地区和我国相关春麦区选育优质面条小麦品种提供种质资源。

1 材料与方法

1.1 材料来源

参试材料为299个宁夏春小麦种质资源，包括地方品种11个，审定品种45个，引进品种12个，高代品系231个，代表了宁夏春小麦生产和育种的现状。对照材料有4个，分别为中国春、陕糯1号(Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1缺失)、Kanto107(Wx-A1、Wx-B1缺失)和白火麦(Wx-D1缺失)。

1.2 基因组DNA的提取

试验材料在恒温培养箱中育苗，剪取单株的新鲜嫩叶，利用CTAB法提取基因组DNA[8]，重复3次，用于Wx基因的检测。

1.3 STS标记的选择

每个Wx基因位点均选用2个分子标记分别进行独立检测，二者结果进行相互验证以保证最终结果的可靠性，所用引物见表1。标记PA1和PA2用来检测Wx-A1位点的变异，标记PB1和PB2用来检测Wx-B1位点的变异，标记PD1和PD2用来检测Wx-D1位点的变异。除PB1和PB2是显性STS标记外，其余4个均为共显性STS标记，引物序列由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

表1 检测目标基因的引物序列及其扩增片段长度Table 1 Sequences and amplified fragment sizes of the primer for targeted genes

共显性标记扩增得到相应的目标条带，则属于相对应的变异类型。例如，利用PA1标记在Wx-A1基因位点扩增得到389 bp条带，则属于野生型；扩增得到370 bp条带，则属于突变型(Wx-A1基因缺失)。显性标记扩增基于有无目标条带进行判断。例如，利用PB1标记对Wx-B1基因位点扩增得到425 bp条带，则属于野生型；若无目标条带，则属于突变型(Wx-B1基因缺失)。

1.4 PCR扩增

PCR反应体系为20 μL，包括2×Es Taq MasterMix(Dye)(北京康为世纪生物科技公司)10 μL，10 μmol·L-1的上、下游引物各0.8 μL，10 μmol·L-1的模板DNA 1.5 μL，用ddH2O补至20 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55～70 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，34个循环；最后72 ℃延伸10 min。

1.5 PCR扩增产物的检测

(1)Wx-D1位点基因的检测：加6 μL Loading buffer溶于扩增产物中，取10 μL扩增产物用 1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，用4S Green Plus 无毒核酸染料(上海生工)胶染法染色，所用电泳缓冲液为0.5×TAE，在130 V恒压下电泳25 min，用紫外成像系统UVP上观察拍照。

(2)Wx-A1和Wx-B1位点基因的检测：扩增产物在5%的变性聚丙烯酰胺上分离，电泳缓冲液为1×TBE，100 W恒定功率电泳30 min，温度上升到35 ℃时，在点样孔中加入变性的扩增产物4 μL,对照Marker DL500(Takara)3 μL，60 W恒定功率电泳1 h，银染法显色后用紫外灯观察，统计结果并保留图像。

2 结果与分析

2.1 Wx-A1位点的检测结果

利用标记PA1和PA2鉴定宁夏春小麦种质资源Wx-A1基因位点的多态性。部分材料的PCR扩增电泳结果如图1所示，白秃子等297个材料与对照中国春一样，分别扩增出389 bp 和336 bp的目的条带，表明其基因型为Wx-A1a；18A5009和18A4328两个材料与对照陕糯1号一样，分别扩增出370 bp和317 bp的目的条带，表明这两个材料的基因型为Wx-A1b。

2.2 Wx-B1位点的检测结果

利用标记PB1和PB2鉴定宁夏春小麦种质资源Wx-B1基因位点的多态性。部分材料的PCR扩增电泳结果如图2所示，白秃子、山麦等267个材料与对照中国春一样，扩增出425 bp和440 bp的目的条带，表明其基因型为Wx-B1a；76N556等32个材料与对照关东107一样，均未扩增出目的条带，表明其基因型为Wx-B1b。

2.3 Wx-D1位点的检测结果

利用标记PD1和PD2鉴定299个宁夏春小麦种质资源中Wx-D1基因位点的多态性。部分材料的PCR扩增电泳结果如图3所示，白秃子、红齐麦等297个材料与对照中国春一样，分别扩增出867 bp和1 400 bp的目的条带，表明其基因型为Wx-D1a；18A4224和18A4327两个材料与对照白火麦一样，分别扩增出279 bp和800 bp的目的条带，表明这两个材料的基因型为Wx-D1b。

2.4 宁夏春小麦种质资源Wx基因的组成与分布规律

从表2可以看出，299个宁夏春小麦种质资源中，Wx基因组成以野生型(Wx-A1a/Wx-B1a/Wx-D1a)为主，占参试材料总数的88.3%。在Wx-A1位点上，野生型Wx-A1a的品种(系)有297个，占参试材料总数的99.3%；突变型Wx-A1b的材料有2个，占参试材料总数的0.7%，分别为18A5009(06G52/宁春33号)和18A4328(永2602/扬糯麦1号)。在Wx-B1位点上，野生型Wx-B1a的品种(系)有267个，占参试材料总数的89.3%；突变型Wx-B1b的品种(系)有32个，占参试材料总数的10.7%，其中地方品种中有1个材料(和尚头)的基因型为Wx-B1b，占地方品种数的9.1%；审定品种中有4个材料的基因型为Wx-B1b，占审定品种数的8.9%，分别为宁春1号、宁春7号、宁春27号、宁春49号；自育高代品系有27个材料的基因型为Wx-B1b，占自育高代品系数的11.7%，分别为18A5004、18A5010、18A4328等。其中18A4328(永2602/扬糯麦1号)的基因型为Wx-A1b/Wx-B1b。在Wx-D1位点上，野生型Wx-D1a的品种(系)有297个，占参试材料总数的99.3%；突变型Wx-D1b的品种(系)有2个，占参试材料总数的0.7%，为优选自育高代品系，分别为18A4224(宁春40号/永2602//宁春33号)和18A4327(永2602/扬糯麦1号)。

表2 299个宁夏春小麦种质资源Wx基因的组成与分布频率Table 2 Composition and frequencies of Wx genes in ningxia 299 wheat germplasm resources

3 讨 论

Wx蛋白直接影响小麦籽粒中直链淀粉含量的高低，进而会影响小麦面粉的上浆粘度、膨胀度和糊化特性，最终决定小麦面粉的用途。已有研究证实，Wx蛋白有Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1三个亚基，且在自然群体中存在有3个蛋白亚基的缺失类型；3个蛋白亚基同时缺失会造成小麦籽粒直链淀粉含量极低，表现为全糯小麦，这种面粉制作的面包具有多孔、胶粘而且容易变形的特点，制作出的面条易碎、柔软且无法保持结构；一个或两个蛋白亚基缺失会引起籽粒中直链淀粉含量在一定程度上的降低，表现为部分糯小麦，这种面粉具有较高的上浆粘度、膨胀度和较好的糊化特性，制成的面条质地柔软且粘性强[3，5]。

本研究表明，宁夏春小麦种质资源Wx基因的组成以野生型(Wx-A1a/Wx-B1a/Wx-D1a)为主，突变型Wx-B1b的频率相对较高，而突变型Wx-A1b和Wx-D1b的频率较低。徐兆华等[12]和杜小燕等[13]的分析结果表明，我国小麦种质资源中Wx蛋白亚基类型主要以单亚基缺失为主，并且主要为Wx-B1缺失类型，兼有Wx-A1和Wx-B1缺失类型。这一结论与宁夏春小麦Wx蛋白亚基的鉴定结果比较一致。

何中虎[14]和刘建军等[15]研究表明，中国小麦品种中Wx-B1蛋白缺失的频率较高，缺失Wx-B1亚基的小麦品种面粉除了表现出直链淀粉较低的特点，而且面粉的高峰粘度大、膨胀势高、用该类型面粉制作加工的面条品质优良。因此，Wx-B1缺失常作为优质面条小麦品种选育的生化指标。299个宁夏春小麦种质资源中，突变型Wx-B1b频率的较高，占参试材料总数的10.7%，其中地方品种占0.3%，引进品种占0.7%，审定品种占1.3%，自育高代品系占9.0%。说明通过小麦育种选择，新品种和高代品系中Wx-B1b类型逐步增加。原因可能是：一方面宁夏春小麦种质资源中通过引进和不断培育优质种质资源，使得该亚基类型的分布频率逐渐增加；另一方面人们对品质改良的重视程度在逐渐增加，育种目标除了重视传统产量及抗性之外，开始兼顾品质 改良。

宁夏引黄灌区主要生产优质硬红春小麦，面条品质改良是小麦育种的主攻目标。不同Wx蛋白亚基缺失降低小麦直链淀粉含量，导致淀粉糊化和膨胀特性的改变，影响面条品质。部分糯质小麦淀粉特性表现出的糊化粘度、稀懈值和膨胀势特征也各不相同，需要进一步筛选或者培育出最适宜用于制做中国面条的种质资源。因此，在今后育种中，应该重视小麦优质亚基和品质相关性的基础理论研究、同时在传统育种工作中引入分子生物学手段，提高优质基因或亚基的筛选效率，从而加速优质面条小麦品种选育的工作。