适用于转录组测序的大麦胚芽鞘保卫细胞分离方法优化

张子轩，郭融融，次而甲玛，王宏鹏，王俊斌，曹高燚，包曙光，谢晓东，陈小强

(天津农学院农学与资源环境学院，天津300384)

大麦(HordeumvulgareL.)是世界上第四大粮食作物，是啤酒工业的基础原料和优良的牲畜饲料，因其遗传多样性丰富，且具备耐旱、耐盐碱、耐重金属、耐缺钾、耐缺氮等优良品质，是研究作物抗逆机理的理想材料[1]。

对于陆地植物来说，气孔是植物体与大气之间交换气体的主要通道，也是植物体失去自身水分最主要的通道[2]。植物体表面的气孔一般由两个保卫细胞围成，是一类高度分化的细胞，它们对于多种内外刺激非常敏感，在感知到环境因子的变化后，迅速对其作出应答，并通过调节气孔的开度来准确而灵敏的作出应激反应，因此，研究保卫细胞与环境因素之间的关系是研究植物对外界环境胁迫应答良好的模式实验系统[3]。保卫细胞在逆境胁迫下，发生膨压改变，导致气孔开度变化，从而影响植物的光合作用、蒸腾作用等生物学过程[4]。分离保卫细胞，对保卫细胞转录组、蛋白质组、代谢组等组学水平的变化进行分析，有利于发现起关键作用的生物学过程和起节点作用的信号组分。

Zeiger等[5]首次对植物保卫细胞原生质体进行分离，此后二段酶处理法逐渐完善[5-8]，这为分子机理的研究提供了材料基础。Obulareddy等[7]研究表明，酶解时间不影响保卫细胞原生质体的纯度和产量，但影响RNA的提取量。此后，该方法也在鸭跖草、拟南芥、蚕豆、甜菜、番茄等植物物种中获得成功，使得保卫细胞的研究渐趋深入[8-12]。

Hetherington等[2]通过对拟南芥、蚕豆等模式植物的研究, 已经掌握了气孔响应环境变化的一些规律。但杨 洋等[13]研究表明，禾本科植物的保卫细胞和模式植物拟南芥的保卫细胞有许多不同之处，拟南芥的保卫细胞是肾形的，而禾本科植物的保卫细胞均为哑铃形。魏 琳等[14]研究也发现，禾本科小麦气孔对生理因子的应答幅度明显大于拟南芥，说明对于粮食安全具有重大意义的大麦、小麦、水稻、玉米等禾本科植物的哑铃形保卫细胞可能使气孔调控更加精细和高效。因而，禾本科植物哑铃形保卫细胞的分离及表达谱的研究亟待开展起来。但禾本科植物保卫细胞为哑铃形，且保卫细胞外有大小相近的副卫细胞，表皮中还有表皮毛、硅化细胞、栓化细胞、边刺等特化细胞，保卫细胞不易从其他细胞中分离出来。此外，禾本科作物的角质层较厚，不利于酶解溶液对细胞壁的解离。因此，分离禾本科哑铃形保卫细胞存在较大困难。其次，就组学研究而言，需要较大数量的保卫细胞，因此对保卫细胞分离技术的要求也较高[15]。

随着新一代高通量测序技术的发展，胁迫诱导的转录组分析已经在一系列禾本科植物中完成，但目前转录组研究主要集中在整株植物、叶片和根系上[16]，由于禾本科植物保卫细胞不易分离，导致RNA提取工作效率低下，质量不高，因此，对保卫细胞转录组进行研究很少。本研究以大麦幼苗胚芽鞘为研究材料，通过优化胚芽鞘表皮条撕取方法，利用优化的一步酶解法分离保卫细胞，以期为进一步提取高质量的大麦幼苗胚芽鞘保卫细胞RNA进行转录组相关研究奠定 基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 大麦种子

供试大麦品种为Morex，由天津农学院天津-布里斯托环境变化对农作物影响研究中心提供。

1.1.2 试验试剂

酶解液配方如下：

酶解基础液100 mL：D-山梨醇9.838 8 g，吗啉乙磺酸0.097 6 g，聚乙烯聚吡咯烷酮K40 0.100 0 g、牛血清白蛋白0.250 0 g，100 μL CaCl2(0.5 mmoL·L-1)、100 μL MgCl2(0.5 mmoL·L-1)、10 μL KH2PO4(10 μmoL·L-1)，DEPC处理水90 mL，pH值调控在5.4～5.8之间，使用KCL与KOH调节，配制完毕于-4 ℃保存。

酶解工作液10 mL：酶解基础液8.5 mL，纤维素酶R-10 0.150 0 g，离析酶R-10 0.050 0 g；1 mL虫草素-5′-三磷酸钠(0.1 mg·mL-1)；500 μL放线菌素-D(0.3 mg·mL-1)；20 μL RNA抑制剂。震荡充分溶解后外覆锡纸隔绝光源，于-20 ℃保存。

荧光素双醋酸酯(FDA)溶液：将0.050 0 g荧光素双醋酸酯溶于10 mL丙酮中，配制成5 mg·mL-1母液，4 ℃避光保存，工作浓度为10 μg·mL-1。

1.2 试验方法

1.2.1 大麦幼苗培养

挑选籽粒饱满、大小均匀的大麦Morex种子150粒，水中浸泡10 min后沥干，剥去稃皮，露出胚部后转移至小烧杯中，70%的乙醇消毒1 min后，用蒸馏水冲洗3次以上，备用。

将铺有医用纱布的发芽盒用蒸馏水润湿，将冲洗过的大麦种子腹沟向下合理密度均匀排列后，半掩盒盖并转移至大麦生长室(温度27± 1 ℃，湿度60±2%，光照强度3 000 lx，光周期 12 h)，浇足水，培养60 h，以24 h为一周期补水。60 h后，待全苗有80%的叶尖露出5 mm的胚芽鞘时，观察大麦幼苗生长情况。

1.2.2 大麦胚芽鞘表皮条的获取

在超净工作台中，准备两个一次性小型培养皿，分别装入DEPC处理水与酶解基础液。取一片DEPC 处理的无菌洁净载玻片作为操作板。滴管吸取少量DEPC处理水于载玻片上，剪取一段符合要求的幼苗移至载玻片，刀片于“V字领”(图1a)起沿愈合线(图1b)纵切幼苗，用无菌镊子剥离胚芽鞘内包裹的大麦幼叶，得到两个半圆柱体空心胚芽鞘段，用无菌刀片去掉3 mm尖端后，外侧向下，使用刀背轻轻“刮压”胚芽鞘近根端5 mm处位置，刀锋不完全切断叶肉层细胞后翻转胚芽鞘至外侧向上，将“刮压”区域向尖端撕去，获得一段胚芽鞘表皮条。之后用解剖针做穿孔处理(在表皮条上用解剖针扎数个小眼)或非穿孔处理并迅速转移至酶解基础液中。重复操作获得足量(≥100)大麦胚芽鞘表皮条。

a：大麦胚芽鞘“V字领”；b：大麦胚芽鞘愈合线。

1.2.3 不同酶解温度和酶解时间下大麦胚芽鞘保卫细胞的分离效果测定

取25支洁净的1.5 mL离心管，每一支加入500 μL酶解液。用解剖针小心挑起表皮条，每支离心管中装入5片，分别在暗环境下置于20、25、30、35和40 ℃水浴锅中，分别水浴处理1、1.25、1.5、1.75和2 h后，用DEPC处理水轻柔漂洗每一片表皮条，于透射显微镜下检测酶解结果，分析最佳酶解效果。

1.2.4 穿孔处理下大麦胚芽鞘保卫细胞的分离效果测定

将大麦胚芽鞘表皮条做穿孔(在表皮条上用解剖针扎数个小眼)和不穿孔两种处理，比较两种处理对大麦胚芽鞘保卫细胞分离的影响。

1.2.5 大麦胚芽鞘保卫细胞活性检测

取未经酶解的大麦胚芽鞘表皮条与酶解彻底的大麦胚芽鞘表皮条，经FDA荧光染色剂染色后置于荧光显微镜下观察，验证酶解法对保卫细胞活性的影响。

1.2.6 转录抑制剂作用下大麦胚芽鞘保卫细胞RNA含量的测定

2 结果及分析

2.1 不同酶解时间、不同酶解温度组合对大麦胚芽鞘保卫细胞分离的影响

从图2可以看出，纤维素酶与离析酶存在最适酶解温度，温度不足导致酶解不彻底(图2a)；温度过高则导致酶失活，造成酶解不彻底和保卫细胞失活(图2b)；工作酶也有一定的活性时间，酶解时间过短导致酶解不彻底(图2c)，酶解时间过长则导致表皮层的蜡质层与角质层受损严重，因此，需要筛选出酶解温度与酶解时间的最佳组合。为了确定酶解温度与酶解时间的最佳搭配，撕取100株大麦胚芽鞘表皮条，酶解温度分别设置为20、25、30、35和40 ℃，酶解时间分别设置为1、1.25、1.5、1.75和2 h，并两两组合，摸索最佳组合，最终确定酶解最佳组合为酶解温度30 ℃、酶解时间1.5 h(图2d)，经过三次重复试验验证，确定该组合是可行的。

a：酶解温度过低的酶解效果；b：酶解温度过高的酶解效果；c：酶解时间不足的酶解效果；d：最适酶解温度和酶解时间(水浴30 ℃，1.5 h)的酶解效果。

2.2 穿孔处理对大麦胚芽鞘保卫细胞分离的影响

将大麦胚芽鞘表皮条做穿孔处理，使酶解液能够渗入其中以提高酶解质量。从图3可以看出，在相同酶解时间(1.5 h)和酶解温度(30 ℃)下，未经穿孔处理的大麦胚芽鞘表皮条(图3a)酶解不彻底，有残留表皮细胞；而经穿孔处理的大麦胚芽鞘表皮条(图3b)酶解彻底，获得的表皮条仅有保卫细胞，比较纯净。

a:未经穿孔处理的大麦胚芽鞘表皮条；b:经穿孔处理的大麦胚芽鞘表皮条。

2.3 大麦胚芽鞘保卫细胞活性检测结果

以透射显微镜观察酶解前后的胚芽鞘表皮条(图4a和4b)为对照，用荧光显微镜观察大麦胚芽鞘表皮条酶解前后的染色结果，可以看出，FDA染色后，胚芽鞘保卫细胞酶解前后均发黄绿色荧光(图4c和4d)，说明本研究酶解法对保卫细胞的活性几乎没有影响或影响很小，可用于后续RNA的提取以及进一步的转录组测序研究。

a：未经酶解的胚芽鞘表皮条；b：酶解后的胚芽鞘表皮条；c：未经酶解FDA染色的胚芽鞘表皮条；d：酶解后FDA染色的胚芽鞘表皮条。

2.4 转录抑制剂对大麦胚芽鞘保卫细胞RNA含量的影响

从表1可以看出，加入虫草素和放线菌素-D两种转录抑制剂的酶解液和未加入两种转录抑制剂的酶解液分别对大麦胚芽鞘麦皮条酶解后，其大麦胚芽鞘保卫细胞所提取的RNA浓度和纯度均相差不大，表明加入转录抑制剂后，对大麦胚芽鞘保卫细胞的RNA含量没有影响。

表1 转录抑制剂对大麦胚芽鞘保卫细胞RNA含量的影响

3 讨 论

气孔是植物与外界进行气体交换的通道。保卫细胞是植物表皮的特化细胞，外界因素通过影响保卫细胞的膨压，控制气孔开放与关闭。目前，已鉴定出与气孔信号转导相关的基因和气孔发育不同阶段的转录因子[17-18]。

随着科技的发展，转录组学已在植物抗病、抗逆和遗传进化过程中得到了广泛的应用。

保卫细胞具有功能的异质性，因而采用组学的技术方法能够从整体水平上全面系统地解析保卫细胞的功能机制。对禾本科植物保卫细胞进行转录组测序及转录组差异性表达分析有可能填补禾本科植物研究领域的空白。但采用组学方法研究保卫细胞功能通常需要大量高质量的保卫细胞，对保卫细胞分离技术的要求较高[15]。

保卫细胞分离纯化工作在双子叶植物中已经有大量的报道，如Fischer等[19]和Willmer等[20]对蚕豆保卫细胞的获取技术都有比较详细的叙述[19-20]；项 燕等[21]采用两步酶解法对蚕豆保卫细胞进行分离，优化撕取环境使获取表皮条的成功率大幅提升；梁 芸等[22]在两步酶解法的基础上，采用更加廉价的纤维素酶，摸索出最佳酶解时间，成功获得大量的拟南芥保卫细胞原生质体。但是鉴于单子叶植物气孔的特点，目前有关单子叶植物保卫细胞分离纯化的相关报道较少。因此，本研究通过优化表皮条撕取方法和利用一步酶解优化法分离大麦胚芽鞘保卫细胞，为提取高质量的大麦幼苗胚芽鞘保卫细胞RNA，以及进一步进行转录组相关研究奠定夯实的基础。

大麦胚芽鞘的保卫细胞在叶片中含量较低，考虑到发芽率和撕取大麦胚芽鞘的成功率，大麦幼苗的总需求量较高，大约在150株左右。而且相对大麦叶片来说，大麦胚芽鞘体积较小，撕取大麦胚芽鞘表皮条的操作难度更高，因此，如何快速获得大量合格胚芽鞘表皮条成为关键。本研究利用优化后的撕取法来获得高质量的大麦胚芽鞘表皮条，效果较好，通过“刮压”这一物理手段人为制造出表皮条与叶肉细胞层的分界，形成便于撕取表皮条的断层。这个改进极大地缩短了大麦胚芽鞘表皮条的获取速度，解决了保卫细胞因离体时间过长导致活性下降甚至死亡的问题，有效保障了后续试验顺利进行。

与两步酶解法比较，使用一步酶解法[23-24]缩短试验时长，从而提高了保卫细胞的存活时间。本研究表明，表皮条须按一定比例和酶解液混合才能有效地分离保卫细胞，且酶解温度及酶解时间对分离保卫细胞的质量和产量影响最大。酶解温度过低或酶解时间太短，细胞壁分解不充分，表皮细胞不能被彻底酶解掉，表皮细胞残留严重，导致保卫细胞RNA不纯，不能进行后续试验研究；酶解温度过高或酶解时间过长则会加重对保卫细胞的损伤，导致保卫细胞从表皮条上提前脱落，活力降低。本研究对工作酶的最适温度与最适时间设置了一系列梯度组合进行摸索，确定了酶解的最佳温度与时间组合(水浴30 ℃、1.5 h)，保证了所获取保卫细胞的纯度和活力。另外，本研究酶解前用解剖针对胚芽鞘表皮条进行穿孔处理，使酶解液很好渗透进入胚芽鞘内部，更快速地酶解掉表皮细胞，结果证实该方法是行之有效的，效果较好。

因保卫细胞RNA的质量会随保卫细胞离体时间的增加而降解，所以在提取RNA时，保证保卫细胞的活性是一个极其重要的环节。为了检测利用上述改进方法提取的保卫细胞是否具有高活力，本研究利用FDA法对大麦保卫细胞进行染色鉴定。FDA是一种非极性物质，本身无荧光，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被细胞内的酯酶裂解成有极性且发绿色荧光的荧光素，由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过观察细胞是否有荧光来确定细胞活性[25]。保卫细胞经FDA染色后，在488 nm激发光下，发黄绿色荧光表示有活力，发红色荧光(叶绿素产生)表示死亡，且亮度越高则活力越强。本研究结果表明，本试验采取的一步酶解法提取的保卫细胞发黄绿色荧光，且酶解前后亮度差别不大，说明酶解对保卫细胞的活性无影响或影响很小，可以用于后续试验。同时，本研究将酶解液基础液作为表皮条暂存液，因酶解基础液中包含维持细胞渗透压和活性的必要元素，能够在酶解过程中提供保持其活性的液体环境，从根本上延长了表皮条保卫细胞的活性，从而为下一步试验奠定基础。

虫草素被发现有抑制mRNA翻译的作用，放线菌素-D则可以抑制RNA的合成特别是mRNA的合成[26]，本研究在酶解液中加入虫草素和放线菌素-D两种抑制剂，并与未加入两种抑制剂的酶解液分别处理大麦胚芽鞘表皮条，对保卫细胞RNA含量进行比较，结果表明，两种抑制剂对RNA的提取量没有太大影响，因此，虫草素与放线菌素-D可作为酶解过程中大麦胚芽鞘保卫细胞RNA的保护剂。

4 结 论

本研究优化了获取大麦胚芽鞘表皮条的方法和酶解方法，从而能够高效提取高活性的大麦胚芽鞘保卫细胞，为进一步转录组测序提供很好的材料来源。通过“刮压”人为制造出表皮条与叶肉细胞层的分界，从而便于撕取表皮条，缩短大麦胚芽鞘表皮条的获取时间；将大麦胚芽鞘表皮条做穿孔处理，使酶解液能够渗入其中以减少酶解时间，提高酶解质量；确定了酶解的最佳温度与时间组合为水浴30 ℃、1.5 h，保证了所获取保卫细胞的纯度和生理活性。在酶解液中加入转录抑制剂(虫草素与放线菌素-D)，避免酶解过程中高温和机械伤害对细胞内基因转录表达的诱导，且不影响RNA含量，保证了酶解前后大麦胚芽鞘保卫细胞RNA含量的一致性以及后续转录组测序的严谨性。