电纺PCL、PLA和PVA纳米纤维膜的制备、表征及细胞活性的研究*

马 可，梁锐明△，苏 伟

（1.广西生物医药协同创新中心 广西－东盟重大疾病防治协同创新中心，南宁 530021；2.广西医科大学第一附属医院创伤骨科，南宁 530021）

静电纺丝技术在国内一般简称为电纺，是一种利用聚合物流体在强电场作用下，通过金属喷嘴进行喷射拉伸而获得直径为几十纳米或几微米纳米级纤维的纺丝技术[1]。静电纺丝技术具有操作简单、成本小、产量高、工艺可控等优势，近年来被广泛应用于各个领域[2-3]。静电纺丝制备出来的纳米纤维膜具有较高的孔隙率、比表面积，形态结构类似于细胞外基质的特点[4]，可以作为组织工程支架、引导骨再生膜、皮肤修复敷料等应用于骨组织、心肌、神经、肌腱再生、神经、心肌、及伤口愈合，在生物医学工程、再生医学等领域有广泛的应用。同时，纳米纤维膜的形态结构、直径大小以及机械性能影响细胞的黏附、迁移、增殖、分化等，因此，制备成具有不同形态结构和机械性能的纳米纤维对组织再生和修复发挥重要作用。

在纳米纤维膜制备过程中，静电纺丝对溶液的浓度有一定的要求，浓度过大导致粘度过高，从而导致难以电纺；溶液浓度过小，聚合物分子链之间缠结不充分，则会导致电纺丝表面出现许多串珠，影响纤维直径[5]。接收速度同样也影响着纤维的形貌和直径，接收速度的增加，纤维被拉伸，直径变细。同时，纤维的结构和平均直径又影响着其机械性能[1]。因此，选择合适的浓度和接收速度是制备出直径分布均匀和排布、较高孔隙率、优良机械性能的纳米纤维膜的关键。此外，电纺纳米纤维的形态结构和直径大小又影响着细胞在其表面的生长状态和增殖能力[6-7]。

本研究选用了良好的生物相容性、良好的生物降解性和FDA批准的聚己内酯（PCL），良好的生物相容性和亲水性的聚乙烯醇（PVA）以及天然的、可降解的脂肪族热塑性聚酯聚乳酸（PLA），利用静电纺丝技术制备不同浓度和接收速度的PCL、PLA 和PVA 纳米纤维膜。通过纤维膜的形貌观察并计算平均直径、机械性能检测，探讨不同浓度和接收速度对纳米纤维膜形态结构和机械性能的影响。同时，将大鼠的骨髓间充质干细胞培养于电纺纳米纤维膜表面，通过CCK-8检测和活死细胞染色来探究纳米纤维膜形态结构和直径大小对细胞生长状况的影响，为电纺纤维膜在生物医学工程和再生医学领域的应用提供理论借鉴。

1 材料和方法

1.1 材料 PCL:纯度≥97%，Sigma-Aldrich，中国；PLA:分析纯，麦克林，中国；PVA:醇解度87%～89%，麦克林，中国；六氟异丙醇：纯度≥99.5%，麦克林，中国。α-Dulbecco’s Modified Eagle Medium(α-DMEM),Gibco，美国；胎牛血清，Gibco，美国；青链霉素混合液，索莱宝，中国；胰蛋白酶，索莱宝，中国；PBS 缓冲液，索莱宝，中国；CCK-8，Dojindo，日本；SD 乳鼠，广西医科大学实验动物中心，中国。Calcein-AM/PI染色试剂盒，Invitrogen，美国。

1.2 仪器 静电纺丝机：HD1311，苏州能环新材料科技有限公司，中国；磁力搅拌器：MSH-20，KEWLAB，澳洲；真空干燥箱：LW-ZDW-4，南京龙伍机械有限公司，中国；电子精密天平：XPE105，METTLER，TOLEDO，瑞士；扫描电子显微镜：TESCAN，VEGA3LMU，捷克；超声波清洗机：SB25-12，宁波新芝生物科技股份有限公司，中国；力学测试仪：Instron 5943，NSTRON，美国。细胞恒温培养箱：BB5，Thermo Fisher，美国；超净工作台：HCB，海尔，中国；倒置相差显微镜：BX53F，OLYMPUS，日本；全波长酶标仪：Multiskan GO，Thermo Fisher，美国。

1.3 实验方法 分别称取适量PCL、PLA、PVA 溶于5 mL 的六氟异丙醇溶液中，配制成不同浓度的PCL（4%、6%和8%）、PLA（8%、10%和12%）、PVA（0.4%、0.8%和1.2%）混合溶液，置于磁力搅拌器上搅拌6 h，并超声30 min 使其充分混匀，制备成静电纺丝溶液。将制备的电纺溶液置于静电纺丝机的注射器上进行电纺。在浓度对纤维膜纤维影响的研究中，选取不同的PCL、PLA和PVA原料浓度，设置纺丝的接收速度为20 r/min；在接收速度对纤维膜纤维影响的研究中，分别选取6% PCL、10%PLA、0.8%PVA 电纺溶液，设置纺丝的接收速度分别为20 r/min、80 r/min和140 r/min进行电纺。其他条件设置为电压为15 kV，喷射速度0.8 mL/h，喷嘴与收集器距离15 cm。环境条件为温度25 ℃，湿度为35%～55%。将上述制备好的纤维膜置于真空干燥箱中干燥24 h后使用。

1.4 纳米纤维膜形态结构、纤维直径和力学性能检测 利用扫描电镜（SEM）观察不同条件制备的PCL、PLA 和PVA 纳米纤维膜的形态结构，并随机选取50根纤维，利用Image软件测量它们的直径分布并计算平均直径。

利用力学仪器对不同条件制备的PCL、PLA 和PVA 纳米纤维膜进行拉伸实验来探究它们的机械性能（拉伸应力、拉伸应变和杨氏模量）。将每一种电纺纳米纤维膜裁剪成大小为20 mm×10 m 的矩形，并用游标卡尺测量纤维膜的厚度，上机测量，设置初始距离为1 cm，拉伸速率为6 mm/min，每个样本重复测量3次。

1.5 细胞培养 向3 d大小的SD乳鼠体内注射3%的戊巴比妥钠溶液，随后将乳鼠置于75%的酒精中灭菌处理。在无菌条件下，利用高压好的剪刀和镊子将乳鼠的四肢剪下，置于含有5%的双抗和PBS缓冲液中，同时将其转移到超净台中进行下一步操作。将四肢取出并用PBS 清洗后，置于培养基中，利用无菌纱布将肌肉组织剔除干净，再将软骨剪下，利用注射器将骨髓冲出到培养皿中。最后，将培养皿置于37 ℃，5%CO2的培养箱中培养，每隔3 d换一次液，取三代细胞进行后续实验。

1.6 细胞接种及活力检测 将电纺纳米纤维膜置于24 孔板中，并用铜环压住，加入75%酒精浸泡6 h，随后，将酒精吸去，在紫外灯下灭菌12 h。将细胞取出，吸去培养液，PBS 清洗3 次，加入2 mL 0.25%的胰蛋白酶消化2 min，再加入2 mL培养基终止消化。将细胞悬液转移到离心管中，1 000 r离心5 min，弃去上清，再加入5 mL 培养基重悬细胞，接着进行细胞计数，最后以3×104细胞/孔的密度接种于纳米纤维膜上，培养3 d。

3 d后取出孔板，将培养液吸去，PBS清洗3遍，在避光的条件下，每孔中加入25 μL CCK-8 和250 μL 培养液，孵育2 h，随后，将24 孔板中的混合液转移到96 孔板中，利用全波长酶标仪在450 nm 处测定吸光度值。3 d 后取出孔板，将培养液吸去，PBS清洗3遍，在避光的条件下，加入活死细胞染色液孵育5 min，吸去染色液，随后在共聚焦显微镜下观察。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 溶液浓度对纤维形态结构和直径的影响 不同浓度（4%、6%和8%）的PCL纳米纤维的扫描电镜图（图1）。当溶液浓度为4%时，纤维表面出现较多的串珠，随着浓度的增加，串珠随之减少。

8%和10%的PLA以及0.4%的PVA的纤维表面出现了串珠，并且随着浓度的增加串珠减少，纤维变得均匀（图2、图3）。

PCL、PLA 和PVA 3 种纤维的平均直径均小于1 μm，并且随着纺丝液浓度的增大，平均直径也随之增大，见表1、表2和表3。

图1 不同浓度的PCL电纺纤维的SEM

图2 不同浓度的PLA电纺纤维的SEM

图3 不同浓度的PVA电纺纤维的SEM

表1 不同浓度的PCL电纺纤维的平均直径和直径分布

表1 不同浓度的PCL电纺纤维的平均直径和直径分布

表2 不同浓度的PLA电纺纤维的平均直径和直径分布

表2 不同浓度的PLA电纺纤维的平均直径和直径分布

表3 不同浓度的PVA电纺纤维的平均直径和直径分布

表3 不同浓度的PVA电纺纤维的平均直径和直径分布

2.2 接收速度对纤维形态结构和直径的影响 浓度分别为6%、10%、0.8%的PCL、PLA和PVA 3种纤维膜在80 r/min和140 r/min的接收速度下的电镜图像，见图4、图5 和图6。与图1b、图2b、图3b 相比，随着转速的加大，纤维的排列逐渐规整，但是由于静电纺丝机的最大转速只能达到140 r/min，所以没有得到排列方向高度一致的纤维。

图4 不同接收速度所得的PCL电纺纤维的SEM

图5 不同接收速度所得的PLA电纺纤维的SEM

图6 不同接收速度所得的PVA电纺纤维的SEM

表4、表5和表6显示，随着转速的加大，纤维直径逐渐变小。

表4 不同接收速度所得的PCL 电纺纤维的平均直径和直径分布

表5 不同接收速度所得的PLA 电纺纤维的平均直径和直径分布

表6 不同接收速度所得的PVA 电纺纤维的平均直径和直径分布

2.3 溶液浓度对纤维膜机械性能的影响 对不同浓度的PCL、PLA 和PVA 3 种纤维膜的力学性能进行了测试，结果表明，随着浓度的增加，3 种纤维膜的力学性能先增加后降低，见表7、表8、表9。

表7 不同浓度的PCL电纺纤维膜的力学性能

表7 不同浓度的PCL电纺纤维膜的力学性能

与4%组比较，*P＜0.05。

表8 不同浓度的PLA电纺纤维膜的力学性能

表8 不同浓度的PLA电纺纤维膜的力学性能

与8%组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

表9 不同浓度的PVA电纺纤维膜的力学性能

表9 不同浓度的PVA电纺纤维膜的力学性能

与0.4%组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2.4 接收速度对纤维膜机械性能的影响 从不同浓度的纤维膜中选出力学性能较好的浓度，分别为6%、10%、0.8%的电纺PCL、PLA 和PVA 3 种纤维膜，将接收速度分别设置为20 r/min、80 r/min 和140 r/min。对通过不同接收速度所得到的纤维膜进行力学测试，结果表明，随着接收速度的增加，3 种纤维膜的力学性能逐渐降低，见表10、表11和表12。

2.5 溶液浓度对纤维膜细胞活力的影响 种植有BMSCs的不同浓度的PCL、PLA和PVA纳米纤维膜的CCK-8 检测结果，见图7。图7a 和图7b 表明，与对照组相比，不同浓度的PCL和PLA纳米纤维膜均可促进细胞增殖（均P＜0.05），并且细胞活力随着浓度的增加而增加（均P＜0.05），而图7c表明，不同浓度的PVA的细胞活力均较对照组低（均P＜0.05）。

表10 不同接收速度所得的PCL电纺纤维膜的力学性能

表10 不同接收速度所得的PCL电纺纤维膜的力学性能

与20 r/min组比较，***P＜0.001

表11 不同接收速度所得的PLA电纺纤维膜的力学性能

表11 不同接收速度所得的PLA电纺纤维膜的力学性能

与20 r/min组比较，**P＜0.01，***P＜0.001。

表12 不同接收速度所得的PVA电纺纤维膜的力学性能

表12 不同接收速度所得的PVA电纺纤维膜的力学性能

与20 r/min组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

种植有BMSCs 的不同浓度的PCL 纳米纤维膜的活死细胞染色结果，见图8。与对照组相比，随着浓度的增加，PCL纳米纤维膜上的细胞数量增多密度增大。

2.6 接收速度对纤维膜细胞活力的影响 从不同浓度的纤维膜中选出力学性能较好的浓度，分别为6%、10%、0.8%的电纺PCL、PLA 和PVA 3 种纤维膜，将接收速度分别设置为20 r/min、80 r/min 和140 r/min。对通过不同接收速度所制备的纤维膜进行CCK-8 检测,结果表明，与对照组相比，不同接收速度的PCL和PLA纳米纤维膜均可促进细胞增殖，并且细胞活力随着接收速度的增加而增加，见图9a和图9b，而当接收速度为20 r/min时，细胞活力低于对照组，随着接收速度的增加，细胞活力随之改善，见图9c。

通过不同接收速度所制备的PCL 电纺纤维膜的活死细胞染色结果，见图10。结果表明，随着接收速度的增加，细胞的形态被拉伸，沿着纳米纤维的方向有序的生长，细胞之间相互连接，趋于融合。

图7 种植有BMSCs的不同浓度的PCL、PLA和PVA电纺纤维膜的cck-8检测结果

图8 种植有BMSCs的不同浓度的PCL电纺纤维膜的活死细胞染色结果

图9 种植有BMSCs并通过不同接收速度所制备的PCL（a）、PLA（b）和PVA（c）电纺纤维膜的CCK-8检测结果

图10 种植有BMSCs并通过不同接收速度所制备的PCL电纺纤维膜的活死细胞染色结果

3 讨论

静电纺丝技术因其操作简单、产量较高、参数可调等优势得到广泛应用。改变参数和纺丝液浓度可以影响所制备出的纳米纤维膜的形态结构和性质功能，从而影响细胞在其表面的生长状态。

在电纺参数相同的情况下，溶液浓度较小时，电纺纤维膜表面易出现串珠，并且纤维直径较小，随着浓度的增加，纤维膜表面结构得到改善并且纤维直径增加。这是因为当溶液浓度过小时，溶液黏度较小，在电场中难以形成射流，聚合物分子链之间缠结不充分，在纤维表面形成一些珠状结构[8-9]。同时，随着溶液黏度的增大，射流在电场中的分化能力得到了降低，导致纤维平均直径增大[10]。随着浓度的增加，纳米纤维表面形态得到改善，串珠减少，这时纳米纤维的结构更好的模拟了细胞外基质，可作为促进细胞生长的良好的支架。本研究结果表明，当浓度相同时，随着接收速度的增加，纳米纤维膜的形态结构趋于规整，直径逐渐变小，这是由于接收速度加快，纤维被过度拉伸，导致纤维的平均直径缩小[11]。通过提高滚筒的接收速度来得到排列有序的纳米纤维，从而提高纳米纤维膜的促细胞生长能力[12-14]。本研究结果显示，当浓度相同时，随着接收速度的提高，纳米纤维排列趋于有序的状态，纤维直径也随之减小，从而增大了空隙，使细胞可以沿着纤维的方向有序生长，较高的孔隙率有利于细胞粘附以及浸润性生长。

参数与溶液浓度的改变不仅影响纳米纤维膜的形态和直径，也会影响其机械性能。当其他参数相同时，随着溶液浓度的增加，3种纤维膜的机械性能先升高后降低，这是由于当纺丝液浓度较小时粘度也较小，此时分子链缠结不良，纤维膜表面结构较差，导致机械性能较低；当浓度逐渐升高时，力学性能得到改善[11]。当浓度进一步增加时，溶液黏度较大，电纺过程受到影响，因此，力学性能随之降低。当溶液浓度相同时，随着接收速度的增加，3种纤维膜的机械性能随之降低。这是由于随着接收速度的增加，纤维被拉伸，直径变细，纤维膜厚度变薄，纤维略微出现取向性，纤维之间的接触点有所减少，导致纤维膜的机械性能变差[11]。

综上所述，通过改变纺丝液浓度和纺丝参数可以改变PCL、PLA 和PVA3 种电纺纳米纤维的表面形貌与直径大小，从而进一步影响了机械性能以及它们对细胞的促生长能力。