鲟源鲁氏耶尔森菌多位点序列分型及耐药谱测定

张小丽，麻强生，焦世璋，宋晓育，马小军

( 1.甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070； 2.甘肃省永靖县农牧局，甘肃 临夏 731600； 3.河南省汝阳县农业农村局，河南 洛阳 471200 )

我国自20世纪90年代开始鲟鱼的商业化养殖，因其具有生长速度快、适应能力强、肉质鲜美和营养丰富等优点，有效地推动了我国淡水养殖业的进一步形成和发展，为养殖户带来了丰厚的经济回报[1]。水产养殖业对保护和缓解渔业资源发挥了巨大作用，但是随着人工养殖规模扩大和密度增加，逐渐产生了新问题，其中就包括细菌性疾病频发。

鲁氏耶尔森菌(Yersiniaruckeri)属肠杆菌科、耶尔森菌属，为革兰氏阴性短杆菌。1966年Rucker[2]从患病虹鳟体内首次分离到鲁氏耶尔森菌。鲁氏耶尔森菌有生物1型和生物2型，生物1型运动力和水解吐温80/20呈阳性，而生物2型呈阴性[3]。有报道表明，该菌主要感染淡水鱼类，但近年来也出现大西洋鲑(Salmosalar)感染鲁氏耶尔森菌的病例，并且逐年增加[4]。鱼类感染鲁氏耶尔森菌主要病变特征为泄殖孔红肿、出血，体表及内脏器官充血、出血等。我国水产养殖中已有虹鳟(Oncorhynchusmykiss)、鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙鱼(Aristichthysnobilis)、斑点叉尾(Ietaluruspunetaus)和鳗鲡(Anguillajaponica)等感染鲁氏耶尔森菌的报道[5-8]。

2019年7—8月，甘肃省刘家峡某鲟鱼养殖场由四川引进的杂交鲟(Acipenserschrenckii♀×A.baeri♂)出现采食量下降，精神沉郁，泄殖孔红肿出血，少数鱼吻部出血。发病时气温28 ℃、表层水温25 ℃，体质量(160±20) g的杂交鲟日死亡率近10%，给养殖者带来了巨大经济损失。为探究杂交鲟发病原因，笔者采集病鱼肝脏进行病原菌分离、鉴定、生物型检测及多位点序列分型，并对其进行耐药谱分析，为鲟鱼细菌性疾病有效防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验用鱼及主要试剂

患病杂交鲟60尾，体质量(160±20) g，同一时间采自甘肃省刘家峡某鲟鱼养殖场。

大肠杆菌(Escherichiacoli)标准质控菌株ATCC25922为本实验室保存；BHI琼脂和BHI肉汤购自青岛海博生物公司；细菌基因组提取试剂盒、2000 DNA Marker和PCR试剂购自诺唯赞(南京)公司；药敏纸片购自广东环凯微生物科技有限公司；基因扩增引物和序列测定由金唯志(天津)公司提供。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离

无菌条件下从60尾病鱼肝脏取样划线接种于BHI平板，28 ℃恒温培养48 h后挑取形态规格一致的单个优势菌落在BHI平板上再次划线培养，获得纯培养菌株后观察菌落形态特征，-80 ℃保存备用。

1.2.2 病原菌鉴定

将纯化的菌株接种BHI肉汤，28 ℃、220 r/min恒温振荡培养12 h后按照细菌基因组提取试剂盒说明书提取基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板扩增16S rRNA，引物为：F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R，5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′；PCR反应体系为：25 μL mix，上下游引物各1 μL，1 μL模板DNA，ddH2O补足至50 μL；PCR循环为：94 ℃ 5 min，30×(94 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s)，72 ℃ 7 min。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后送至金唯智(天津)公司进行测序。

测序结果在数据库上BLAST比对分析后，根据测定的16S rRNA序列与相关属(种)16S rRNA序列利用MEGA 7.0软件以邻接法构建系统发育进化树，各个分支的Bootstrap值选择2000[9]。

1.2.3 生物型检测

分离株穿刺接种半固体培养基，28 ℃恒温培养24～48 h后观察分离株生长状况。仅沿穿刺线生长为阴性，表明无运动力；沿穿刺线生长且穿刺线两侧出现明显的羽毛状或云雾状为阳性，表明有运动力[10]。分离株菌液用无菌生理盐水适量稀释后取0.2 mL均匀涂布于吐温80水解培养基，28 ℃培养24～48 h后观察菌落周围是否出现浑浊，不出现浑浊为阴性，表明不水解吐温80；出现浑浊为阳性，表明水解吐温80[11]。因为大肠杆菌标准质控菌株ATCC25922有运动力且能够水解吐温80，所以接种在上述2种培养基与分离菌株同等环境和时间培养后作为对照组。

1.2.4 多位点序列分型

根据鲁氏耶尔森菌MLST数据库(https://pubmlst.org/yruckeri/)提供的6个管家基因和引物进行多位点序列分型。PCR反应体系为：25 μL mix，上下游引物各1 μL，1 μL模板DNA，ddH2O补足至50 μL；PCR循环参照鲁氏耶尔森菌MLST数据库进行(表1)。扩增结果经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后送至金唯智(天津)公司进行双向测序。

测序结果用DNASTAR软件进行拼接、质量验证，登录鲁氏耶尔森菌MLST数据库，对每株菌的6个管家基因序列进行查询比对，得到相应的等位基因编码，按照glnA、gyrB、dnaJ、thrA、hsp60和recA的排列顺序，确定菌株的ST型。

表1 扩增鲁氏耶尔森菌管家基因的引物和反应条件Tab.1 Primers and reaction conditions for amplification of the housekeeping genes of Y. ruckeri strain

1.2.5 系统发育分析

每株分离株的不同等位基因序列通过MEGA 7.0软件Clustal W功能进行比对分析，串联6个管家基因采用邻接法进行Bootstrap值为2000次的重复构建系统发育树。

1.2.6 耐药谱测定

分离株接种于BHI琼脂，选用强力霉素、卡那霉素、氟苯尼考、阿莫西林、大观霉素、多黏菌素、恩诺沙星、诺氟沙星、氨苄西林和阿米卡星等10种药敏纸片，参照美国临床实验室标准化委员会抗生素敏感试验操作方法和判定标准进行纸片扩散法抑菌试验[12]，总结归纳出耐药谱。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离鉴定

60尾患病杂交鲟泄殖孔均红肿出血，部分病鱼还出现吻部出血；剖检后肝脏均有明显出血点，部分病鱼胆汁外溢，肾脏、心脏和脾脏无明显变化(图1)。60尾患病鲟鱼肝脏中每尾都分离到1株优势菌株，在BHI平板上形成边缘整齐、表面光滑、透明的圆形菌落；16S rRNA序列与在美国国立生物技术信息中心网站BLAST中的鲁氏耶尔森菌16S rRNA序列同源性达99%，且在系统发育树中与鲁氏耶尔森菌聚为一支(图2)。所以，60尾患病鲟鱼肝脏中分离到的病原菌是鲁氏耶尔森菌，命名为LJX1～LJX60。

图1 患病死亡杂交鲟外观和病理剖检Fig.1 Appearance and pathological examination of sick hybrid sturgeon A. schrenckii ♀ × A. baeri ♂a.外观； b.吻部出血； c.泄殖孔红肿出血； d.肝脏出血； e.胆汁外溢.a.the hybrid sturgeon appearance; b.bleeding in the snout of hybrid sturgeon; c.the cloacal swelling and redness of the hybrid sturgeon; d.bleeding liver in hybrid sturgeon; e.bile spill in hybrid sturgeon.

2.2 生物型检测

60株鲁氏耶尔森菌在半固体培养基仅沿穿刺线生长，说明无运动力；在吐温80水解培养基未出现明显的浑浊，说明不水解吐温80。综上所述，60株鲁氏耶尔森菌分离株均为生物2型(图3)。

2.3 多位点序列分型

6个管家基因glnA、gyrB、dnaJ、thrA、hsp60和recA经PCR扩增后电泳均获得清晰单一条带(图4)。6个管家基因序列在鲁氏耶尔森菌MLST数据库中比对，得到相应等位基因编码和ST型，共获得6种ST型，未发现新的ST型(表2)；其中ST1有40株，ST2有8株，ST3有3株，ST5有2株，ST8有1株，ST13有6株(表3)。

图2 60株鲁氏耶尔森菌16S rRNA基因序列构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree constructed from 16S rRNA gene sequences of 60 Y. ruckeri strains Group1是60株分离株，Group2是与分离株同源性高的菌株，Group3是耶尔森菌属其他种. Group 1 is 60 isolates, Group 2 is a strain with high homology to the isolate, and Group 3 is other Yersinia species.

图3 60株鲁氏耶尔森菌的生物型检测Fig.3 Biotype detection of 60 Y. ruckeri strainsa.穿刺试验空白对照； b.鲁氏耶尔森菌分离株穿刺试验； c.大肠杆菌标准质控菌株ATCC25922穿刺试验； d.水解吐温80试验空白对照； e.鲁氏耶尔森菌分离株水解吐温80试验； f.大肠杆菌标准质控菌株ATCC25922水解吐温80试验.a.blank control in a puncture test; b.piercing test of Y. ruckeri strains; c.puncture test of E.coli standard quality control strain ATCC25922; d.blank control in a hydrolysis Tween 80 test; e.Y. ruckeri strains in hydrolyzed Tween 80 test; f. E.coli standard quality control strain ATCC25922 in a hydrolysis Tween 80 test.

图4 6个管家基因电泳结果Fig.4 Electrophoresis of six housekeeping genes

表2 60株鲁氏耶尔森菌ST型

(续表2)

表3 60株鲁氏耶尔森菌MLST信息表Tab.3 MLST information on 60 strains of Y. ruckeri

2.4 系统发育分析

6个管家基因序列串联后对60株鲁氏耶尔森菌分离株进行系统发育树分析，结果显示，系统发育树有2个明显的分支Group1和Group2，在Group1中有ST3、ST5和ST8，而Group2中没有这3种ST型，说明此次分离株在进化关系上有较大的差异；ST1、ST2和ST13鲁氏耶尔森菌分离株在Group1和Group2均有，说明此次分离株即使是同一来源地的同一ST型，在进化关系上也有明显的差异(图5)。

图5 60株鲁氏耶尔森菌6个管家基因串联系统发育树Fig.5 A phylogenetic tree of six housekeeping genes of 60 strains of Y. ruckeri

2.5 耐药谱测定

选用10种抗生素来测定60株鲁氏耶尔森菌分离株的药物敏感性，得到了9种耐药谱(表4)。由表4可见，60株鲁氏耶尔森菌分离株有19株对10种抗生素均敏感；耐1种抗生素的有18株，耐2种抗生素的有7株，耐3种抗生素的有8株，耐4种抗生素的有4株，耐5种抗生素的有4株。说明此次鲁氏耶尔森菌分离株耐药类型多样，其中多重耐药现象普遍，耐卡那霉素和恩诺沙星的比例最高，分别为43%和30%。结合耐药谱和ST型发现，对10种抗生素都敏感的有6种ST型，即ST1、ST2、ST3、ST5、ST8和ST13；耐1种抗生素的有ST1、ST2和ST13；耐2种抗生素的有ST1、ST2和ST13；耐3种、4种和5种抗生素的有ST1。3种耐药谱中有ST13，4种耐药谱中有ST2，9种耐药谱中全部都有ST1。综上，本试验结果显示，此次60株鲁氏耶尔森菌ST型可能与耐药性无显著相关性。

表4 60株鲁氏耶尔森耐药谱Tab.4 Drug resistance range of 60 strains of Y. ruckeri

3 讨 论

3.1 我国鲟鱼细菌性疾病研究

近年来我国鲟鱼养殖规模不断扩大，虽然给养殖者带来可观的经济收入，但也逐渐出现了养殖密度增加和环境破坏等现象，随之而来的是水质下降和细菌性疾病频发。目前，我国报道鲟鱼感染的细菌主要有停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiae)、海豚链球菌(S.iniae)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)和鲁氏耶尔森菌等[13-16]，细菌性疾病已经严重威胁到我国鲟鱼的养殖。

3.2 生物型和ST型相关性分析

鲁氏耶尔森菌目前有生物1型和2型，最近的研究显示，生物1型的菌体长度大于生物2型，并且生物2型常暴发于接种过疫苗的鱼类[3]。鲁氏耶尔森菌出现2种生物型是由生物2型flhA或flhE基因缺失或flhA基因突变[17]所致。决定鲁氏耶尔森菌ST型的6个管家基因不包括flhA和flhE基因，所以生物型与ST型没有相关性。

3.3 相同ST型的进化关系分析

鲁氏耶尔森菌MLST数据库目前收录了30种ST型，本试验分离到6种ST型，占比为20%，说明此次鲟鱼感染的鲁氏耶尔森菌ST型较复杂。本试验串联6个管家基因系统发育树表明此次鲁氏耶尔森菌分离株即使是同一时间、同一来源地的相同ST型，在进化关系上也有明显的差异，这可能是鲁氏耶尔森菌在侵染宿主时或者在宿主体内随着时间的推移，个别管家基因的某些位点发生了突变，导致同一ST型的不同个体出现差异。

3.4 耐药性和ST型相关性分析

本研究选用10种抗生素对60株鲁氏耶尔森菌进行药敏性分析，共发现9种耐药谱，其中耐卡那霉素和恩诺沙星的比例最高，分别为43%和30%。此次试验结果显示，鲁氏耶尔森菌分离株的耐药谱有所增加，杨昆明等[1]研究显示，鲟源鲁氏耶尔森菌对卡那霉素和恩诺沙星敏感，而本研究结果显示，有36株鲁氏耶尔森菌对卡那霉素和恩诺沙星明显耐药；方苹等[6]研究显示，鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙鱼(Aristichthysnobilis)源鲁氏耶尔森菌对恩诺沙星敏感，而本试验结果显示，有18株鲁氏耶尔森菌对恩诺沙星明显耐药；本试验中也有24株鲁氏耶尔森菌分离株对卡那霉素和恩诺沙星敏感，这与杨昆明等[1,6]的研究结果相同。以上结果说明不同分离地区、不同水域、不同宿主和不同用药情况均可导致鲁氏耶尔森菌的耐药性出现不同。

耐药谱和ST型的相关性分析结果显示，3种耐药谱中有ST13，4种耐药谱中有ST2，9种耐药谱中均有ST1，即使是同一ST型的不同个体耐药情况也不相同。因此笔者认为ST型可能和耐药性之间没有联系，这可能是由同一ST型分离株的耐药基因的某个位点发生突变或者是不同ST型分离株的耐药基因相同所致。

3.5 临床症状和病理变化与ST型相关性分析

本试验中60尾患病杂交鲟除了出现共同的临床症状(泄殖孔红肿出血)和病理变化(肝脏出血)之外，其中5尾吻部出血，肝脏处分离到5株ST1型鲁氏耶尔森菌，即菌株LJX1、LJX8、LJX32、LJX34和LJX38；3尾胆汁外溢，肝脏处分离到3株ST1型鲁氏耶尔森菌，即菌株LJX21、LJX31和LJX36；1尾既出现吻部出血又出现胆汁外溢，肝脏处分离到1株ST1型鲁氏耶尔森菌，即LJX60。所以，笔者认为，鲟鱼感染同一ST型鲁氏耶尔森菌可能会有不同的临床症状和病理变化，感染不同ST型鲁氏耶尔森菌可能出现相同的临床症状和病理变化。这种现象的发生可能是同一ST型鲁氏耶尔森菌的某些致病基因发生突变或者是不同ST型鲁氏耶尔森菌的致病基因相同，还可能与鲟鱼不同个体间的免疫系统出现差异有关。国内报道鲟鱼感染鲁氏耶尔森菌的主要症状为泄殖孔红肿外突，偶见腹部、胸鳍部和嘴部出血；剖检变化主要是肝脏出血甚至坏死，心脏、肾脏和脾脏等脏器的病变[1,16,18-19]；而本试验结果表明，鲁氏耶尔森菌还可导致鲟鱼吻部出血和胆汁外溢。

3.6 国内外研究及防治策略分析

目前国内外鲁氏耶尔森菌致病性的研究还不够完善，大多是依赖基因组学和蛋白质组学方法来识别基于序列的毒力基因[20-22]。针对这种重要的经济鱼类病原菌，未来的研究应该通过试验来解决毒力基因、耐药性、耐药基因、ST型、生物型和血清型相互之间的关系，这些都将是防治鱼类鲁氏耶尔森菌病的重要理论基础。接种商品化疫苗已成为预防鱼类鲁氏耶尔森菌病暴发的重要途径[23]；几乎各国在治疗鱼类鲁氏耶尔森氏菌病时都使用抗生素，虽然短期效果明显，但是长期使用抗生素容易导致病原菌产生耐药性，造成水体环境污染，引起食品安全等诸多问题。陶健等[24]发现，中草药黄芩和诃子对鲟源鲁氏耶尔森菌有明显的抑菌作用，为鱼类鲁氏耶尔森菌病的防治提供了新方向。

4 结 论

本试验中杂交鲟出现大批死亡是感染6种不同ST型(ST1、ST2、ST3、ST5、ST8和ST13)的生物2型鲁氏耶尔森菌所致。