抗菌肽Fa-AMP基因的克隆及其原核表达载体的构建

李 蒙，刘 璞，张芝星

(西安文理学院 生物与环境工程学院，陕西 西安 710065)

抗菌肽(Antimicrobial Peptide)是一类具有抗菌活性的小分子多肽的总称，是由宿主产生的能够抵抗外界病原体感染，抗菌肽具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用，尤其是其对某些耐药性病原菌的杀灭作用更引起了人们的重视[1]。广泛存在于各种生物体内，在微生物、植物和动物体中均有发现并成功分离获得。直接从生物体内提取抗菌肽产量低、费时长、工艺复杂[2-6]。因此，通过分子生物学技术合成人工抗菌肽是高效制备的理想选择。

荞麦(FagopyrumesculentumMoench.)是一种药食兼用的经济作物，具有较高的营养价值和保健功能，如防癌、降血糖、降血脂、抗衰老等多种生理功能。其中，蛋白质作为荞麦中重要的生物活性物质，具有抗菌等不同生理活性[7]。Zhang等[8]将荞麦抗菌肽编码基因在原核系统重组表达，表达产物rBT对IM-9细胞系等具有生长抑制活性。赵红倩等[9]通过Plackett-Burman和Box-hnken试验并联优化苦荞蛋白酶解制备抗菌肽，发现对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用。并且发现其不但可以抑制肝癌细胞HepG2、肺癌WRL68、白血病L1210等细胞的生长，甚至可以抑制艾滋病病毒HIV-1的逆转录酶活性[10]。因此，荞麦抗菌肽是多功能活性肽，在抵抗微生物感染、提高机体免疫力等研究领域有着很好的应用前景。

目前，已在多种植物中发现了抗菌肽，Fujimura等[11]首次从甜荞中分离得到了Fa-AMP1和Fa-AMP2抗菌肽，两者在结构中十分相似，仅在C端有一个氨基酸差异，具体的分子结构有待进一步阐明。本研究拟通过基因工程手段获得荞麦Fa-AMP1和Fa-AMP2抗菌肽的原核表达菌株，为高效制备具有生物活性荞麦抗菌肽的开发利用提供重要的研究手段。

1 材料与方法

1.1 材料

原核表达载体pET-47b(+)、大肠杆菌BL21(DE3)pLysS和DH5α均由西安文理学院生物与环境工程学院实验室保存。

1.2 试剂

BamHⅠ、XhoⅠ核酸限制性内切酶，DNA分子量Marker；pGM-T Vector载体；Taq PCR Mastermix；DNA纯化试剂盒；质粒提取试剂盒。

1.3 抗菌肽基因设计及引物合成

根据NCBI数据库中抗菌肽Fa-AMP1(accession P0DKH7.1)和Fa-AMP2(accession P0DKH8.1)蛋白质序列分析，采用大肠杆菌中密码子偏嗜性设计抗菌肽的核苷酸，Fa-AMP1氨基酸序列(AQCGAQGGGATCPGGLCCSQWGWCG STPKYCGAGCQSNCK)，Fa-AMP2氨基酸序列(AQCGAQGGGATCPGG LCCSQWGWCGSTPKYCGAGCQSNCR)，Fa-AMP1核苷酸序列(5′-GCTC AATGTGGTGCTCAAGGTGGTGGTGCTACCTGTCCTGGTGGT TTGTGTTGTTCTCAATGGGGTTGGTGTGGTTCTACCC CAAAGTACTGTGGTGCTGGTTGTCAATCTAACTGTAA A-3′)；Fa-AMP2核苷酸序列(5′-GCTCAATGTGGT GCTCAAGGTGGTG GTGCTACCTGTCCTGGTGGTTTGTGTTGTTCTCAATGGGGTTGGTGTGGTTCTACCCCA AAGTACTGTGGTGCTGGTTGTCAATCTAACTGTAGA-3′)。

1.4 抗菌肽基因的合成和原核表达载体构建

根据Fa-AMP1和Fa-AMP2优化后的核苷酸序列，设计具有互补重叠区的引物，利用Vector NTI软件设计的5条互补引物(表1)，分别为Fa1、Fa2、Fa3、Fa4、Fa5引物，采用重叠区扩增基因拼接法，多步PCR获得目的基因。

Fa-AMP1抗菌肽基因获得的PCR反应体系(25 μL)：Fa1、Fa2、Fa3、Fa4这4种引物各1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP(each10 mmol/L)0.5 μL，Pfu DNA酶0.5 μL，ddH2O 17.5 μL。Fa-AMP2抗菌肽基因获得的反应体系(25 μL)：Fa1、Fa2、Fa3、Fa5这4种引物各1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP(each10 mmol/L)0.5 μL，Pfu DNA酶0.5 μL，ddH2O 17.5 μL。

PCR程序：94 ℃预变性1 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，循环30次；72 ℃终延伸10 min。反应结束后使用1.0%琼脂糖凝胶进行DNA电泳分析，产物置于-20 ℃保存。经Tap酶扩增连接到pGM-T Vector载体，转化到大肠杆菌DH5α,阳性克隆经PCR和测序(上海生物工程公司)鉴定。

表1 合成Fa-AMP基因的引物

Fa-AMP1和Fa-AMP2经测序鉴定正确后，重新设计带有BamHⅠ和XhoⅠ核酸限制性内切酶的上下游引物，Fa-AMP1和Fa-AMP2的上游引物(5′-ACTCGGGATCCGGCTCAATGTGGTGCTCAAGGTGGTG-3′，下划线为BamHⅠ酶切位点)，Fa-AMP1的下游引物(5′-ACACCGCTCGAGTTTACAGTTAGATTGACAACCA GC-3′，下划线为XhoⅠ酶切位点)，Fa-AMP2的下游引物(5′-ACACCGCTCGAGTCTACAGTTAGATTGACAACCAGC-3′，下划线为XhoⅠ酶切位点)；以测序正确的基因为模板进行PCR扩增，扩增条件：94 ℃预变性1 min；94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s(Fa-AMP1为65 ℃，Fa-AMP2为64 ℃)，72 ℃延伸20 s，循环30次；72 ℃终延伸10 min。使用核酸限制性内切酶对纯化的PCR产物和原核表达质粒pET-47b(+)进行双酶切，酶切后构建重组真核表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，对再次重组的表达载体进行测序。

1.5 序列比对与分析

利用ExPASy在线进行氨基酸序列分析(https://web.expasy.org/translate/)，等电点及分子量预测(https://web.expasy.org/protparam/)；在NCBI数据库中进行氨基酸序列比对；二级结构预测采用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)；空间结构预测采用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)。

2 结果与分析

2.1 目的基因的鉴定

Fa-AMP1和Fa-AMP2抗菌肽基因的多步PCR扩增产物，使用1.0%琼脂糖凝胶进行DNA电泳分析，由图1和图2可知，100～250 bp间有特异性条带，符合预期结果，连接到pGM-T Vector载体测序结果也表明与实验前期设计的Fa-AMP1和Fa-AMP2抗菌肽基因一致，在线软件预测Fa-AMP1和Fa-AMP2的重组蛋白分子量分别为6.49和6.52 kDa，等电点为6.97。

M:DL2000；1～4：Fa-AMP1基因的PCR扩增结果。图1 Fa-AMP1基因的PCR扩增结果

2.2 基因与载体的酶切

使用核酸限制性内切酶对纯化的Fa-AMP1和Fa-AMP2基因和原核表达载体pET-47b进行双酶切及检测(图3和图4)，酶切成功后进行连接。

2.3 构建重组表达载体

连接转化后，构建的重组表达载体pET-47b+Fa-AMP1和pET-47b+Fa-AMP2进行PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示(图5)，100～250 bp间有特异性条带，符合预期结果，重组表达载体测序结果显示构建成功。

M:DL2000；1:pET-47b的双酶切结果。图4 质粒pET-47b的双酶切结果

M:DL2000；1：Fa-AMP1重组质粒PCR扩增结果；2：Fa-AMP2重组质粒PCR扩增结果；3：pET-47b+Fa-AMP1重组质粒； 4：pET-47b+Fa-AMP2重组质粒。

2.4 生物信息学分析

获得基因通过NCBI数据库中比对，结果显示氨基酸序列一致，通过SOPMA对Fa-AMP1和Fa-AMP2进行二级结构预测，结果发现在它们的二级结构中α螺旋所占比例为5%和2.5%，β折叠所占比例为15%，无规则卷曲所占比例为80%和82.5%，说明其蛋白的二级结构以β折叠和无规则卷曲为主。利用在线ExpASy的SWISS-MODEL对其进行三级结构预测显示是多肽的无规则卷曲(图6)。

图6 抗菌肽Fa-AMP的三级空间结构预测

3 讨论

抗菌肽是生物天然免疫防御系统的重要组成部分，由特定基因编码，具有广谱抗菌活性，除了具有抗细菌作用外，还具有抗真菌、抗肿瘤活性、抗病毒、降血压、免疫调节等功效[12]，它是具有生物学活性的多个氨基酸组成的多肽[13]，深入研究荞麦小分子活性肽，对于荞麦蛋白资源的开发利用具有重要的意义。

植物抗菌肽在一级结构方面相当保守序列，即分子内都含丰富的分子内二硫桥，二硫桥是体外合成多肽技术面临的重要难题[14]。人工合成虽可获得与天然抗菌肽一致的氨基酸序列，但是常常不能形成正确的空间结构，且成本昂贵，使其仅停留在实验室试验阶段，同样，体外分离天然抗菌肽或抗菌蛋白也是费时费力。因此，本次实验通过基因工程的方法成功构建荞麦抗菌肽的原核表达载体pET-47b+Fa-AMP1和pET-47b+Fa-AMP2，下一步进行体外表达是短时间得到大量抗菌肽产物的好方法；为获得具有生物活性的抗菌肽，后续实验可通过优化诱导表达条件，选择合适的融合蛋白标签进行体外表达，是短时间获得具有生物活性且规模化生产制备抗菌肽的理想选择。