白花蛇舌草内生真菌BY1不同提取部位对人胃癌细胞SGC-7901增殖和凋亡的作用研究

陈龙，陈裕凤，张淼，李永燕，沈运连，许立拔

（广西中医药大学，广西南宁530200）

胃癌（gastric cancer，GC）是一种以胃为原发部位的上皮源性恶性肿瘤，胃癌细胞恶性增殖和侵袭能力强，预后差，5年生存率较低［1-2］。目前，胃癌的主要治疗手段是手术切除联合化疗，常用的化疗药物有5-氟脲嘧啶、阿帕替尼、奥沙利铂、表阿霉素和多西他赛等，化疗药物有一定疗效，但副作用大，对患者身体伤害较大，在临床长期使用受限［3］。中医药作用缓和，常用于改善手术后并发症，减轻放、化疗的不良反应，从而提高患者的体质和生活质量。因此，利用中医药理论指导筛选天然产物，发现并开发出低毒高效的抗胃癌新药意义重大。

白花蛇舌草［Hedyotis diffusaWilld.或Oldenlandia diffusa（Willd.）Roxb.］属于茜草科耳草属植物，有清热解毒、利尿消肿、活血止痛的功效［4］，对大肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等均有抑制作用［5-9］。内生真菌与宿主植物共生长，代谢产物丰富，很多内生真菌与宿主植物的活性成分和功效相似，同时内生真菌还有抑制有害细菌、分泌营养物质有助宿主生长的作用［10-11］。研究表明，多种内生真菌和宿主一样具有抗肿瘤活性，如莪术内生真菌和宿主一样具有抗肝癌和胃癌活性；同时内生真菌代谢产物如黄酮类化合物，也具有明显的肿瘤抑制作用［12-14］。有研究表明，白花蛇舌草及其黄酮类化合物对人胃癌细胞SGC-7901具有明显的抑制作用，并可诱导其凋亡［15-17］。目前，白花蛇舌草内生真菌及其代谢产物对胃癌的研究尚未见报道，本研究采用MTT法和Hoechst 33258染色法测定白花蛇舌草内生真菌BY1不同提取部位对SGC-7901细胞的增殖抑制作用和凋亡变化，探讨白花蛇舌草内生真菌BY1治疗胃癌的作用，现报道如下。

1 实验材料

1.1 菌株及肿瘤细胞株白花蛇舌草采集于广西壮族自治区南宁市青秀区，经鉴定为茜草科耳草属植物白花蛇舌草（Hedyotis diffusaWilld）；白花蛇舌草内生真菌BY1菌株（BY1）由广西壮瑶药重点实验室分离提供；人胃癌细胞SGC-7901购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.2 试剂RPMI-1640培养基（批号8118276）、0.25%胰蛋白酶（批号1951208）为赛默飞世尔（苏州）仪器有限公司产品；胎牛血清（批号18060505）为浙江天杭生物科技股份有限公司产品；四甲基偶氮噻唑蓝（MTT，批号413Y053）、磷酸缓冲盐溶液（PBS液，批号20181226）、二甲基亚砜（DMSO，批号821D038）、青链霉素混合液（批号20180927）和5-氟脲嘧啶（5-FU，批号1015D021）均为北京索莱宝科技有限公司产品；石油醚（批号20181024）、乙酸乙酯（批号20170103）、氯仿（批号20180305）和甲醇（批号20170613）均为国药集团化学试剂有限公司产品；乙醇消毒液（批号20181030）为广西博亨医疗用品有限公司产品。

1.3 仪器KQ-500DA数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BSA224S电子天平（感量：0.1 mg，赛多利斯科学仪器有限公司）；Epoch2酶标仪（美国Bio-Tek公司）；ZW-A微量震荡器（常州荣华仪器制造有限公司）；C170二氧化碳培养箱（德国BINDER公司）；CKX53倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）；VORTFX-5漩涡混匀器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；HWS-28电热恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司）；BSC-1000ⅡA2生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）。

2 方法

2.1 BY1不同部位提取液的制备取干燥BY1菌丝适量，剪碎，置于三角烧瓶中，加入10倍量石油醚，40 kHz超声提取30 min，过滤，共3次。合并3次滤液，减压浓缩（温度不超过60℃）挥干溶剂，所得菌丝体按先后顺序分别加入10倍量的乙酸乙酯、氯仿、甲醇超声提取3次，合并滤液减压浓缩至稠膏，分别得乙酸乙酯部位（1 g相当于106.38 g菌丝）、氯仿部位（1 g相当于200 g菌丝）和甲醇部位（1 g相当于84.74 g菌丝）稠膏，置于干燥器内保存备用。取无菌BY1乙酸乙酯部位、氯仿部位和甲醇部位在超净工作台内，使用旋涡混匀器，加入含10%胎牛血清的1640完全培养液，旋涡混匀稀释成相应浓度的含培养基药液。

2.2 细胞培养将人胃癌细胞SGC-7901接种于培养瓶，培养环境为二氧化碳培养箱，设置37℃、5%CO2、饱和湿度，培养液为含10%胎牛血清和1%青链霉素（含青霉素80 U/ml和链霉素0.08μg/ml）的1640完全培养液，2～3 d换液1次，3～5 d传代1次。

2.3 同浓度下BY1不同提取部位对人胃癌细胞株SGC-7901增殖抑制率的影响取BY1乙酸乙酯部位、氯仿部位和甲醇部位稠膏，加入含10%胎牛血清的1640完全培养液，调配终浓度均为250μg/ml，另设空白组和5-氟脲嘧啶组（25μg/ml）。取对数生长期人胃癌细胞SGC-7901，调节密度至5×104个/ml细胞悬液。在96孔板中，每孔加入100μl细胞悬液（约5 000个/孔）。常规培养24 h后，吸弃原培养液，在相应孔中加入200μl相同浓度含完全培养基的药液，每个样品重复6个复孔。培养48 h后，每孔分别加入20μl MTT溶液（5 mg/ml）继续孵育4 h，弃上清液，每孔加入100μl DMSO，振荡10 min使溶出物充分溶解，用酶标仪在490 nm波长处测定各孔OD值，分别计算细胞生长抑制率。抑制率（%）=（空白组OD值-给药组OD值）/空白组OD值×100%。

2.4 BY1不同提取部位对人胃癌细胞SGC-7901半数抑制浓度（IC50）的影响参照文献［18］方法，取BY1不同提取部位，乙酸乙酯部位设置5个浓度，分别为1 000μg/ml，416μg/ml，173μg/ml，72μg/ml和30μg/ml；氯仿部位设置5个浓度，分别为500μg/ml，247μg/ml，122μg/ml，61μg/ml和30μg/ml；甲醇部位设置5个浓度，分别为1 000μg/ml，495μg/ml，245μg/ml，121μg/ml和60μg/ml；另设空白组。取对数生长期人胃癌细胞SGC-7901，调节密度至5×104个/ml细胞悬液，在96孔板中每孔加入100μl细胞悬液。常规培养24 h后，吸弃原培养液，在相应孔中加入200μl不同浓度含完全培养基的药液，每个样品浓度重复6个复孔。培养48 h后，分别于每孔加入20μl MTT溶液（5 mg/ml），继续孵育4 h后弃上清液，每孔加入100μl DMSO，振荡10 min使溶出物充分溶解，用酶标仪在490 nm波长处测定各孔OD值，分别计算细胞生长抑制率及各样品半数抑制浓度（IC50）。

2.5 BY1不同提取部位对人胃癌细胞SGC-7901细胞核凋亡形态的影响参考文献［19］方法，取BY1不同提取部位，乙酸乙酯部位设置4个浓度，分别为1 000μg/ml，416μg/ml，173μg/ml和72μg/ml；氯仿部位设置4个浓度，分别为500μg/ml，247μg/ml，122μg/ml和61μg/ml；甲醇部位设置4个浓度，分别为1 000μg/ml，495μg/ml，245μg/ml和121μg/ml；另设5-氟脲嘧啶组（10μg/ml）和空白组。取对数生长期的人胃癌细胞SGC-7901调整至1×106个/ml，接种至6孔板（内置无菌盖玻片），每孔1 ml，约1×106个/孔，观察细胞增长至约80%时，吸弃原培养液，按设计加入不同浓度的含药培养基，每孔1 ml。继续培养36 h后，吸弃原培养液，用PBS液2 ml清洗3次，再用10%中性福尔马林液0.5 ml固定15 min后吸弃培养液。用PBS液2 ml清洗3次，加入Hoechst 33258染色液0.5 ml，室温避光染色20 min，用PBS液2 ml清洗3次，取出盖玻片，晾干，用抗荧光淬灭封片液封片，于荧光显微镜下观察细胞核凋亡形态并拍照。

2.6 统计分析使用SPSS 21.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组数据采用One-Way ANOVA分析，两组间采用LSD test分析；非正态和/或方差不齐的数据，多组数据采用Kruskal-Wallis H分析，两组间采用Mann-Whitney U分析。P＜0.05为有统计学差异。

3 结果

3.1 同浓度下BY1不同提取部位对人胃癌细胞SGC-7901增殖的影响见表1。

表1 同浓度下白花蛇舌草内生真菌BY1不同提取部位对人胃癌细胞SGC-7901增殖的影响（x±s，n=6）

表1 显示，与空白组比较，BY1乙酸乙酯部位、氯仿部位、甲醇部位和5-氟脲嘧啶对人胃癌细胞SGC-7901均有显著抑制作用（P＜0.01），细胞增殖抑制率分别为55.38%、58.69%、24.92%、65.03%。

3.2 BY1不同提取部位不同浓度对人胃癌细胞SGC-7901的影响见表2～表4、图1～图3。

表1 ～表3、图1～图3显示，BY1不同提取部位对人胃癌细胞SGC-7901均有明显的细胞毒性作用，浓度-增殖抑制率曲线呈S型，符合Logistic曲线特征；与空白组比较，BY1不同提取部位各浓度OD值或增殖抑制率差异均具有显著性意义（P＜0.05或P＜0.01），BY1乙酸乙酯部位、氯仿部位、甲醇部位对人胃癌细胞SGC-7901的IC50值 分 别 为380.53±40.07μg/ml、177.37±11.53μg/ml和1 077.80±40.17μg/ml。

3.3 BY1不同提取部位对人胃癌细胞SGC-7901细胞核凋亡形态的影响见图4～图6。

在荧光显微镜下，空白组人胃癌细胞株SGC-7901细胞细胞核荧光反应较弱，细胞凋亡数目较少，形态规则；BY1不同部位对人胃癌细胞SGC-7901均有明显的促进凋亡作用，细胞核形态随着药物浓度增大而发生核固缩聚集，细胞核不规则样变，浓度越大，细胞核畸形数目增加；且细胞核荧光反应随药物浓度呈正相关，浓度越大，荧光反应加强，细胞凋亡数目增加，其中氯仿部位促进人胃癌细胞SGC-7901凋亡作用最为显著。

表2 白花蛇舌草内生真菌BY1不同浓度乙酸乙酯部位对人胃癌细胞SGC-7901的影响（x±s，n=6）

图1 白花蛇舌草内生真菌BY1乙酸乙酯部位对人胃癌细胞SGC-7901的增殖抑制曲线

表3 白花蛇舌草内生真菌BY1不同浓度氯仿部位对人胃癌细胞SGC-7901的影响 （x±s，n=6）

图2 白花蛇舌草内生真菌BY1氯仿部位对人胃癌细胞SGC-7901的增殖抑制曲线

表4 白花蛇舌草内生真菌BY1不同浓度甲醇部位对人胃癌细胞SGC-7901的影响 （x±s，n=6）

图3 白花蛇舌草内生真菌BY1甲醇部位对人胃癌细胞SGC-7901的增殖抑制曲线

图4 白花蛇舌草内生真菌BY1乙酸乙酯部位对人胃癌细胞SGC-7901细胞凋亡形态的影响

图5 白花蛇舌草内生真菌BY1氯仿部位对人胃癌细胞SGC-7901细胞凋亡形态的影响

图6 白花蛇舌草内生真菌BY1甲醇部位对人胃癌细胞SGC-7901细胞凋亡形态的影响

4 讨论

胃癌是常见的消化道癌症之一，胃内炎性环境是促进胃细胞癌变和生长的主要因素，已有研究表明，炎症环境可促进多种癌症形成和发展［20］。胃癌的发生发展与胃癌细胞的增殖和凋亡失衡密切相关，胃细胞DNA复制的不稳定性，导致细胞周期紊乱，可刺激胃细胞癌变，故治疗胃癌，应抑制胃癌细胞增殖，并诱导其程序性死亡。胃癌易转移，存活率低于其他肿瘤，一般发现已是中晚期，无法根治，只能进行长时间的放疗、化疗，但副作用大，严重损伤机体，降低了患者的生活质量。中医药在防治胃癌方面有着独特的优势，主要是通过抑制胃癌细胞增殖和促进其凋亡，从而达到抑制胃癌细胞生长的目的［21］。

本研究采用MTT法和Hoechst 33258染色法观察白花蛇舌草内生真菌BY1不同提取部位对SGC-7901细胞的增殖抑制和促进凋亡作用。研究结果表明，白花蛇舌草内生真菌BY1不同提取部位对SGC-7901细胞呈浓度依赖性抑制，由强到弱依次为氯仿部位、乙酸乙酯部位和甲醇部位，并可有效促进胃癌细胞凋亡，主要表现为癌细胞形态的改变，如核固缩、核碎片和聚集等，促凋亡作用呈剂量-效应关系。

白花蛇舌草内生真菌BY1对胃癌细胞具有良好的增殖抑制和促进凋亡作用，提示其可用于胃癌的防治，其作用机制可能与内生菌的抑菌、抗炎和改变胃内炎症内环境有关；也可能与内生菌及其代谢产物有免疫调节作用，增强机体免疫功能，减少淋巴管和血管生成，抑制癌细胞的生长和转移有关，具体机制尚有待进一步研究。