HPLC法测定藏药三果汤中没食子酸、三没食子酰基葡萄糖和五没食子酰基葡萄糖的含量

黄宽　林艾和　张艳娇　范源

【摘 要】 目的：建立同时测定藏药三果汤中3种成分含量的HPLC法。方法：采用高效液相色谱法测定余甘子中没食子酸（Gallica acid，GA）、1，3，6-O-三没食子酰基葡萄糖（1，3，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose，TGG）和1，2，3，4，6-O-五没食子酰葡萄糖（1，2，3，4，6-O-galloyl-D-glucose，PGG）的含量。色谱柱为Agilent Zorbax C18键合硅胶柱（150mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱，流速为0.8mL/min，检测波长为260nm，柱温为25℃，进样量为10μL。结果：GA、TGG和PGG分别在0.3910～3.9100mg/mL（r=1，n=6），0.1300～1.300mg/mL（r=0.9998，n=6），0.0710～0.7100mg/mL（r=0.9999，n=6）范围内呈良好的线性关系，加样回收率均符合含量测定要求。结论：该方法简便、准确，可以用于藏药三果汤中GA、TGG和PGG成分的含量测定。可为三果汤中相关成分的质控提供一定理论参考。

【关键词】 HPLC;藏药三果汤;没食子酸;1，3，6-O-三没食子酰基葡萄糖;1，2，3，4，6-O-五没食子酰葡萄糖

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2021）04-0036-04

Abstract：Objective A HPLC method for simultaneous determination of three components in Tibetan medicine Triphala decoction was established.Methods The contents of Gallica acid（GA）， 1，3，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose（TGG） and 1，2，3，4，6-O-galloyl-D-glucose（PGG） in Phyllanthus emblica were determined by HPLC. The chromatographic column was Agilent Zorbax C18 bonded silica gel column （150mm×4.6mm，5μm）， mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid gradient elution， the flow rate was 0.8mL/min， the detection wavelength was 260nm， the column temperature was 25℃， and the injection volume was 10μL.Results GA，TGG and PGG showed a good linear relationship in the range of 0.3910～3.9100mg/mL，0.1300～1.300mg/mL and 0.0710～0.7100mg/mL， respectively. The recoveries of added samples all met the requirements of content determination.Conciusion The method is simple， accurate and can be used for the determination of GA， TGG and PGG in Tibetan medicine Triphala decoction. It can provide some theoretical reference for the quality control of related components in Triphala decoction.

Keywords：HPLC; Tibetan Medicine TriphalaDecoction; Pyrogallic acid; 1，3，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose; 1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucose

藏药三果汤又名哲布汤，由余甘子、诃子、毛诃子组成，是藏药中重要的常见基础方，具有调节“隆”和“血”的功效。三果汤始载于《四部医典》，具有治疗瘟疫、紊乱热症、促使热症成型的作用[1]。传统中医学认为三果汤方中余甘子味甘、酸、涩，归肺、胃经，性涼;诃子味苦、酸、涩，归肺、大肠经，性平;毛诃子味甘、涩，性平。三味药合用具有清热、调和气血的功效。

现代药理学研究表明，三果汤具有抗菌[2]、抗炎[3-4]、抗肿瘤[5-6]、抗氧化[7-8]、降糖[9]、降脂[10]等药理作用。三果汤主要含有鞣质酚酸类成分[11]，没食子酸是鞣质的重要组成成分，其常见的衍生物为1，3，6-O-三没食子酰基葡萄糖和1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基葡萄糖，研究发现没食子酸及其酯类衍生物都具有抗癌药理活性[12-13]。目前研究单味药的化学成分含量及药理活性较为常见，而对三果汤复方研究较少。本研究针对三果汤中没食子酸及其衍生物1，3，6-O-三没食子酰基葡萄糖、1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基葡萄糖进行含量测定，为提高藏药三果汤质量控制提供理论基础。

1 仪器与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司），色谱柱为 Agilent Zorbax C18键合硅胶柱（150mm×4.6mm，5μm）;DFY-600摇摆式高速万能粉碎机（永康式速锋工贸有限公司）;T-1000型电子天平（上海浦春计量仪器有限公司）;AB265-SMETTLER TOLEDO十万分之一分析天平（梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司）。

没食子酸（Gallica acid，GA）购自四川省维克奇生物科技有限公司（批号：wkq16081904）、1，3，6-O-三没食子酰基葡萄糖（1，3，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose，TGG）购自武汉天植生物技术有限公司（批号：CFS201802）、1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基葡萄糖（1，2，3，4，6-O-galloyl-D-glucose，PGG）购自成都普瑞法科技开发有限公司（批号：PRF10011001）;乙腈（色谱纯），磷酸（分析纯）购自天津市风船化学试剂有限公司;Agilent 1200高效液相色谱仪，色谱柱为 Agilent Zorbax C18键合硅胶柱（150mm×4.6mm，5μm）;电子天平（购自北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱条件：色谱柱为Agilent C18柱（4.6mm×150mm，5μm）;流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液;梯度洗脱：0～6min，4%～8%;6～30min，8%～20%;30～55min，20%～40%;检测波长260nm;柱温：25℃;流速：0.8mL/min;进样量为10μL。色谱图如图1所示。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取GA、3GG、PGG对照品3.9mg、1.3mg、0.7mg，置于10mL量瓶中，用甲醇配制成含GA、3GG、PGG 0.39mg/mL、0.13mg/mL、0.07mg/mL的混合对照品溶液，用0.45μm的微孔滤膜进行过滤处理，备用。

2.2.2 供试品溶液 取诃子、毛诃子、余甘子药材（去核）各5.0g，捣碎，加入100mL馏水，浸泡30min，煎煮3次，每次20min，过滤，合并3次滤液，浓缩10mL的三果汤水提物，吸取水提物1mL，加50%甲醇定容50mL容量瓶中，冷藏备用。用0.45μm的微孔滤膜进行过滤处理，即得到样品溶液。

2.3 线性关系考察 配制不同质量浓度的对照品溶液，在“2.1”项条件下依次连续进样，以质量浓度（mg/mL）为横坐标（X），峰面积（mAU*s）为纵坐标（Y）进行线性回归，绘制标准曲线，结果见表1，表明各成分均具有良好的线性关系。

2.4 精密度 试验精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液，在“2.1”项条件下连续进样6次，结果显示GA、TGG、PGG峰面积RSD分别为1.22%、1.58%、1.01%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液，在“2.1”项条件下，分别于2、4、6、8、10、12h进样，结果显示GA、TGG、PGG 10 h内峰面积的RSD值分别为0.77%、1.39%、1.08%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验 取同一批三果汤粉末6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项条件下进样，结果显示GA、TGG、PGG含有量RSD分别为1.18%、0.37%、0.83%，表明该方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一批三果汤粉末6份，每份精密称取5.0g，按“2.2.2”项下方法制备供试溶液，加入GA、TGG、PGG对照品适量（约相当于5.0 g样品中所含GA、3GG和PGG的量），再按“2.3”项下色谱条件，进样10μL，进行检测，计算平均回收率。按“2.2.3”项下方法制备供试溶液，在“2.1”项条件下进样。结果见表2。

2.8 含量测定 取3份不同批次余甘子样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下条件下进样，计算四种成分含有量。结果见表3。

3 讨论

三果汤作为传统藏药在临床上应用广泛，且具有良好的临床疗效。鞣质酚酸类化合物是三果汤的主要有效成分，易溶于水，故本研究采用水提的方式处理样品。对比煎煮次数，结果显示，煎煮三次时，含量达到最高。

预实验分别以甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液作为流动相进行考察，当乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相时，采用梯度洗脱，目标峰的色谱图峰拖尾得到改善，且峰形更好，达到更高的分离度，因此选定乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相。另外，还对柱温（25、30、35、40℃）和流速（0.5、0.8、1.0、1.2、1.5mL/min）进行了优化，结果显示，柱温25℃、流速0.8mL/min 时分离效果较佳。

本研究建立同时测定藏药三果汤中没食子酸、1，3，6-O-三没食子酰基葡萄糖、1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基葡萄糖含量的高效液相色谱法，供试品制备简便，结果准确，重复性好，专属性高，结果可靠，可为三果汤质量控制提供一定依据。

參考文献

[1]德洛， 姚喆， 冀静， 等. 藏药三果汤散抗氧化有效成分的薄层色谱-生物自显影及HPLC指纹图谱[J]. 中国实验方剂学杂志， 2012， 18（12）： 98-102.

[2]RAMALINGAM K， AMAECHI B T. Antimicrobial effect of herbal extract of Acacia arabica with triphala on the biofilm forming cariogenic microorganisms[J]. Journal of Ayurveda and Integrative Medicine， 2018， S0975-9476（17）30459-X.

[3]SIREERATAWONG S， JAIJOY K， Soonthornchareonnon N， et al. Evaluation of anti-inflammatory and antinociceptive activity of Triphala recipe[J]. African Journal of Traditional， Complementary and Alternative Medicines， 2013， 10（2）： 246-250.

[4]KALAISELVAN S，RASOOL M K. Triphala herbal extract suppresses inflammatory responses in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages and adjuvant-induced arthritic rats via inhibition of NF-κB pathway[J].Immunotoxicol， 2016， 13（4）：509-525.

[5]TSERING J， HU X. Triphala Suppresses Growth and Migration of Human Gastric Carcinoma Cells In Vitro and in a Zebrafish Xenograft Model[J]. Biomed Res Int， 2018：7046927.

[6]CHERIYAMUNDATH S， MAHADDALKAR T， SAVE S N， et al. Aqueous extract of Triphala inhibits cancer cell proliferation through perturbation of microtubule assembly dynamics[J].Biomed Pharmacother. 2018（98）：76-81.

[7]PRASAD S， SRIVASTAVA S. Oxidative Stress and Cancer： Chemopreventive and Therapeutic Role of Triphala[J]. Antioxidants， 2020， 9（1）：72.

[8]李軒豪，刘兰茹，龙伟， 等.基于计算药理学的藏药三果汤散抗氧化研究[J].中华中医药杂志，2018，33（9）：4139-4142.

[9]GANESHPURKAR A， JAIN S， AGARWAL S， et al. Experimental studies on glycolytic enzyme inhibitory and antiglycation potential of Triphala[J]. Ayu （an International Quarterly Journal of Research in Ayurveda）， 2015， 36（1）： 96-100.

[10]BANJARE J， RAINA P， MANSARA P， et al. Triphala， regulates adipogenesis through modulation of expression of adipogenic genes in 3T3-L1 Cell line[J]. Pharmacognosy Magazine， 2017， 13（52）：S834-S839.

[11] 王文军， 丁一， 窦芳， 等. 藏药三果汤散化学成分、质量控制及药理作用研究概况[J]. 中国药房， 2019， 30（4）： 556-559.

[12]LOCATELLI C， FILIPPIN-MONTEIRO F B， CRECZYNSKI-PASA T B. Alkyl esters of gallic acid as anticancer agents： A review[J]. European Journal of Medicinal Chemistry， 2013（60）： 233-239.

[13]CHOUBEY S， VARUGHESE L R， KUMAR V， et al. Medicinal importance of gallic acid and its ester derivatives： A patent review. Pharm Pat Anal， 2015， 4（4）： 305-315.

（收稿日期：2020-08-25 编辑：刘斌）