三种不同剂型的通脉丸溶出行为比较研究

赵新红，康冰亚，陈天朝*

（1.承德医学院附属医院 药学部，河北 承德 067000；2.河南中医药大学第一附属医院 药学部，河南 郑州 450000）

通脉丸是由两头尖、黄芪、丹参、制马钱子等多味中药组成的河南中医药大学第一附属医院院内制剂，主治风寒湿痹、骨节疼痛、痈肿、四肢痉挛、动脉硬化闭塞性脉管炎等动脉缺血性疾病所致的寒凝脉络型脱疽[1]。本研究在前期研究基础上[1-7]，采用HPLC 法测定三种不同剂型通脉丸溶出液中阿魏酸、芍药苷、丹酚酸B、橙皮苷、竹节香附素A 含量，紫外分光光度法测定总黄酮含量，依据指标成分在处方中的地位及药理作用不同，选择层次分析法（Analytic Hierarchy Process，AHP）来构造指标成分相对重要性判断矩阵，依托矩阵实验室(Matrix Laboratory，Matlab)软件确定指标成分权重系数，应用模型依赖法与拟合因子法对三种不同剂型的通脉丸溶出行为进行比较，旨在从体外溶出以及剂型因素角度出发，为通脉丸下一步深入研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；TU-1800PC 型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；ZRS-8C 型智能溶出试验仪（天津大学无线电厂）。

1.2 样品与试药

芦丁对照品（批号：100080-201806）、丹酚酸B对照品（批号：111562-201806）、阿魏酸对照品（批号：110773-201811）均购于中国食品药品检定研究院，纯度均为100%；芍药苷对照品（批号：201804）、竹节香附素A 对照品（批号：201808）、橙皮苷对照品（批号：201804）均购于四川维克奇生物科技有限公司，质量分数均大于98%；甲醇、乙腈、磷酸（色谱纯，迪马公司）；水为自制超纯水；其余试剂为分析纯。

三种不同剂型的通脉丸（水丸、蜜丸、散剂批号分别为180801、180810、180812；规格：每袋均为5 g），由河南中医药大学第一附属医院制剂室提供。

2 方法与结果

2.1 HPLC 法测定通脉丸溶出液中5 种指标成分含量

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Agilent SB-Aq C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm），Agilent SB-Aq C18保护柱（1.0 mm × 20 mm，5 μm）；以乙腈（A）- 0.1%磷酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱（A：0 ～ 15 min，16% ～ 20%；15 ～ 28 min，20% ～ 25%；28 ～54 min，25% ～ 58%；54 ～ 56 min，58% ～ 16%；56 ～65 min，16%）；流速：0.8 mL/min；柱温：35℃；检测波长：芍药苷、橙皮苷、丹酚酸B 为260 nm，阿魏酸为316 nm，竹节香附素A 为206 nm；进样量：20 μL。理论塔板数不低于4 000。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 取芍药苷、阿魏酸、橙皮苷、丹酚酸B、竹节香附素A 对照品适量，精密称定，加甲醇定容，制成质量浓度分别为17.20、15.60、10.77、31.60、47.68 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 选择《中国药典》2020年版（四部）通则0931“溶出度与释放度测定法”中的第二法（桨法），以超声30 min 处理的900 mL超纯水为溶出介质，温度为（37 ± 0.5）℃，转速为100 r/min，投药前确保溶出介质保温30 min，取通脉丸适量，精密称定，置于溶出杯中，分别在投药后的

2、5、10、20、30、40、60、120、240、1 440 min取样10 mL，立即补充同温度溶出介质10 mL，溶出液过滤，滤渣置于溶出杯中，滤液保存，备用。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液1、2、3、5、10、20 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，得到回归方程分别为：芍药苷，Y = 1 404 782.3X +2 416.8，r = 0.999 4；阿魏酸，Y =9 536 596.3X－ 2 220.8，r = 0.999 5；橙皮苷，Y =2 457 334.9X－ 16 276.7，r = 0.999 6；丹酚酸B，Y =667 005.8X－ 7 867.4，r = 0.999 4；竹节香附素A，Y = 390 439.5X－ 8 273.6，r = 0.999 5。结果显示芍药苷在0.017 ～ 0.344 μg，阿魏酸在0.016 ～ 0.312 μg，橙 皮 苷 在0.011 ～ 0.215 μg， 丹 酚 酸B 在0.032 ～0.632 μg，竹节香附素A 在0.048 ～ 0.954 μg，进样量与峰面积之间线性关系良好。

2.1.5 精密度、稳定性、重复性试验 取同一供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行精密度、稳定性、重复性考察，结果精密度、稳定性、重复性试验的芍药苷、阿魏酸、橙皮苷、丹酚酸 B、竹节香附素A 峰面积的RSD 值均小于2%，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.6 加样回收率试验 平行称取通脉丸（蜜丸）6 份，按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别加入相当于样品含量的混合对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果芍药苷、阿魏酸、橙皮苷、丹酚酸B、竹节香附素A 的平均加样回收率分别为100.49%、98.76%、 99.72%、100.27%、97.32%，RSD 值均小于2%，表明该方法准确度良好。

2.2 紫外分光光度法测定通脉丸溶出液中总黄酮含量

2.2.1 对照品溶液的制备 取芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇适量，制成质量浓度为0.229 mg/mL的对照品溶液。

2.2.2 线性关系考察 精密吸取芦丁对照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0 mL， 分 别 置50 mL的容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液2 mL，摇匀静置6 min；加10%硝酸铝溶液2 mL，摇匀静置6 min；加4%氢氧化钠溶液10 mL，加水至刻度线，摇匀静置15 min。以相应的试剂为空白，紫外分光光度法在500 nm 波长处测定各个对照品溶液的吸光度。以对照品质量浓度为横坐标（X），吸光度值为纵坐标（Y），进行线性回归，得到回归方程为Y ＝ 0.011 3X ＋0.009 8（r ＝ 0.999 8），表明芦丁质量浓度在4.58 ～91.60 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.2.3 方法学考察 取通脉丸溶出液，按“2.2.2”项下方法进行精密度、重复性、稳定性和加样回收率试验，结果精密度、重复性、稳定性试验的总黄酮吸光度的RSD 值均小于2%；平均回收率为100.02%，RSD 值为1.48%，表明方法学考察符合要求。

2.3 AHP 法确定通脉丸溶出液中6 种指标成分的权重系数

根据6 种指标成分在通脉丸处方中君臣佐使配伍关系及各组分药理作用不同，借助AHP 法确定指标成分的权重系数，选择专家咨询方法，依据Saaty 等提出的9 级比例标尺[8]，对指标成分相对重要性进行两两比较，构造判断矩阵，Matlab 软件来计算指标成分的权重系数及随机一致性比率（consistency ratio，CR），结果竹节香附素A、总黄酮、丹酚酸B、阿魏酸、芍药苷、橙皮苷的权重系数分别为0.258 9、0.258 9、0.135 7、0.135 7、0.135 7、0.075 0，CR = 0.002 2 ＜ 0.10，说明6 种指标成分的权重系数计算结果合理、可信。根据指标成分的权重系数及累积溶出率计算公式[9]，Matlab R2014a 软件计算三种不同剂型的通脉丸综合评价指标的累积溶出率，并实现结果可视化，见图1。

2.4 三种不同剂型的通脉丸溶出行为比较

2.4.1 模型依赖法 由于模型依赖法不仅可以进行溶出度数据拟合，还能比较参考制剂与受试制剂之间溶出参数的差异性[10]。因此，选择SAS 8.1 软件对Weibull 分布模型（y = 100*{1-exp[-b*（t-a）m]}，y 为累积溶出率%，t 为溶出时间min，a、b、m 为模型参数）等6 种常见溶出模型进行优选[11]，结果Weibull 分布模型为最优溶出模型。采用1stOpt 1.5 软件中的麦夸特法+通用全局优化法对Weibull分布模型参数进行估算[12]，见表1。

图1 不同剂型的通脉丸累积溶出率（±s，n = 6，%）Fig. 1 The cumulative dissolution rate in different dosage forms of Tongmai Pill （±s，n = 6，%）

表1 1stOpt 软件估算Weibull 分布模型参数（±s，n = 6）Tab. 1 The Weibull distribution model parameters estimated by 1stOpt software（±s，n = 6）

表1 1stOpt 软件估算Weibull 分布模型参数（±s，n = 6）Tab. 1 The Weibull distribution model parameters estimated by 1stOpt software（±s，n = 6）

剂型 Weibull 分布模型参数 拟合评价指标a r2 RMSE散剂 1.835 5 ± 0.099 1 0.978 4 ± 0.048 5 0.189 1 ± 0.012 1 0.974 6 ± 0.012 4 2.058 4 ± 0.580 6水丸 1.983 2 ± 0.008 7 0.577 8 ± 0.007 7 0.201 8 ± 0.011 0 0.969 1 ± 0.012 0 3.000 4 ± 0.624 3蜜丸 1.447 2 ± 0.066 5 0.146 2 ± 0.012 8 0.401 6 ± 0.015 8 0.992 5 ± 0.002 7 1.602 1 ± 0.328 2 b m

为进行不同剂型不同溶出率的溶出时间比较，SAS 8.1 软件计算一定溶出率下的溶出时间Tn，SPSS 19.0 统计软件进行单因素方差分析及相同溶出率时不同剂型的溶出时间两两比较，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，以 P ＜ 0.05 为差异具有统计学意义，结果三种不同剂型的通脉丸溶出时间Tn之间存在显著性差异（P ＜ 0.05），见表2。

2.4.2 拟合因子法 拟合因子法属于溶出行为比较中的非模型依赖法，包括差异因子f1和相似因子f2两种方法，具体计算公式如下：

注：n 为溶出度的取样点数，Rt 与Tt 分别为在t 时间点处实验制剂与参比制剂的溶出率，一般设定Wt = 1[13-14]

根据f1值大于15，f2值小于50，可以判断实验制剂和参比制剂的溶出行为有差异[15-16]的原则，结合计算结果可知，散剂、水丸、蜜丸的f1值大于15，f2值小于50，表明三种剂型之间的溶出行为比较，差异具有统计学意义（P ＜ 0.05），结果见表3。

3 讨论

对通脉丸溶出液中6 种指标成分进行综合评价，是本研究的关键步骤之一。由于层次分析法是一种解决多目标的复杂问题的定性与定量相结合，在对评价指标主观判断的基础上引入数学检验的决策分析方法，比较符合中药多组分、多靶点的特点。因此，选择层次分析法进行6 种溶出指标综合评价。然而，该方法当指标超过9 个时，存在两两比较的判断工作量较大，容易引起评价专家的主观判断混乱，从而无法确定指标权重系数等不足之处。

表2 不同剂型不同溶出率的溶出时间比较（±s，n = 6，min）Tab. 2 Compare dissolution time of different dissolution rate in different dosage forms（±s，n = 6，min）

表2 不同剂型不同溶出率的溶出时间比较（±s，n = 6，min）Tab. 2 Compare dissolution time of different dissolution rate in different dosage forms（±s，n = 6，min）

注：相同溶出率时不同剂型溶出时间两两比较，字母不同，表示P ＜ 0.05

溶出率/% 散剂 水丸 蜜丸 F P 20 1.84 ± 0.10a 1.99 ± 0.01b 4.35 ± 0.49c 72.063 0.000 30 1.85 ± 0.10a 2.07 ± 0.01b 9.61 ± 1.03c 165.093 0.000 40 1.87 ± 0.08a 2.53 ± 0.03b 24.14 ± 2.06c 339.926 0.000 50 2.00 ± 0.06a 6.46 ± 0.27b 49.93 ± 3.00c 696.561 0.000 63.2 2.98 ± 0.23a 17.41 ± 3.14b 118.10 ± 3.37c 2 965.630 0.000 70 4.88 ± 0.60a 38.10 ± 2.07b 193.20 ± 2.79c 7 365.684 0.000 75 8.24 ± 1.19a 81.29 ± 1.53b 273.96 ± 2.28c 7 863.037 0.000

表3 拟合因子法比较不同剂型的通脉丸溶出行为Tab. 3 The dissolution behaviors of different dosage forms of Tongmai Pill compared by fitting factor method

在Weibull 分布模型参数a、b、m 的估算过程中，比较了规划求解法、列文伯格-马夸尔特法、信赖域法、遗传算法、麦夸特法+通用全局优化法等5种算法对a、b、m 估算结果的影响[11-12,17]，结果5种算法对a、b、m 的估算结果进行比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。

由于水丸与蜜丸的溶出参数T70分别为（38.10 ±2.07）min、（193.20 ± 2.79）min，通过与普通化学制剂T70应小于45 min 进行比较，可知水丸接近于缓释制剂，蜜丸属于缓释制剂。为了初步探讨通脉丸（蜜丸）指标成分的释放机制，选择缓控释制剂释放评价模型Ritger-Peppas方程对蜜丸释放曲线进行拟合[18]，结果发现橙皮苷释药机制为Fick 扩散与溶蚀共存（0.45 ＜ n = 0.51 ＜ 0.89），其它5 种指标成分为Fick 扩散（n ＜ 0.45）。

4 结论

本研究建立了通脉丸溶出液中6 种指标成分的含量测定方法，应用模型依赖法和拟合因子法对水丸、蜜丸、散剂三种不同剂型的通脉丸溶出行为进行比较，结果发现水丸、蜜丸、散剂三种剂型之间的溶出行为的比较，散剂溶出最快，水丸次之，蜜丸最缓。同时，初步考察通脉丸（蜜丸）中6 种指标成分的释药机制，结果橙皮苷释药机制是Fick 扩散与溶蚀共存，其它5 种指标成分属于Fick 扩散。由于本研究仅比较三种不同剂型的通脉丸在单一溶出介质（纯水）中的溶出行为。下一步课题组将选择不同溶出介质进行溶出行为比较，进一步揭示通脉丸释药原理及机制，并开展指标成分体内外相关性等研究。