基于二氧化硅、百草枯、博莱霉素建立3种大鼠肺纤维模型的差异蛋白质组学分析

肖梦珂，贾岩龙

(1. 新乡医学院公共卫生学院，河南 新乡 453003；2. 新乡医学院药学院，河南 新乡 453003)

肺纤维化(pulmonary fibrosis, PF)是一种以早期肺泡炎症、晚期成纤维细胞异常增生转化以及细胞外基质(extracellular matrix, ECM)大量沉积等为特征的肺间质性疾病[1]。PF发病机制复杂，并且无特异临床表现，早期诊断比较困难；PF作为一种病因不明的慢性进行性肺疾病，无法治愈，确诊后的中位生存时间只有2～3 a[2]。同位素标记相对与绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)结合液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)分析具有高通量设置、高灵敏度和高准确性等显著优势，目前已成为一种强大的定量蛋白质组学方法[3]。iTRAQ技术已被广泛用于各种差异蛋白的研究，如胃癌中人血清差异表达的蛋白人血清、结核分枝杆菌、小鼠急性肺损伤等[4-6]。近些年来，PF的研究取得了重大进步，确定了一些细胞因子在PF发生、发展中的作用，但是这些作用并不能完全解释PF发病中的所有现象[7]。因此，从整体水平加强对PF发病机制的研究，明确其发生、发展的分子机制，并在此基础上确定新的治疗策略就成为非常迫切的现实需要。

在以肺部炎症和进行性纤维化为特征的肺部疾病影响着数千万长期在粉尘环境中工作的人，肺内晶体二氧化硅的吞噬引起溶酶体损伤，激活核苷酸结合寡聚化结构域样受体3炎症小体，触发炎症级联，随后发生纤维化[8]。百草枯是一种水溶性有机杂环化合物，一般作为强效除草剂使用，可导致肺泡上皮细胞损伤，甚至死亡。随着肺泡细胞的破坏，肺毛细血管进一步破裂导致肺泡内出血和肺部感染。最后，PF可发生在肺泡ECM的肺细胞周围，这种情况称为“百草枯肺”[9]。博莱霉素是一种水溶性糖肽类抗生素。博莱霉素注入人体后，分布到机体各组织器官中，因为肺和皮肤细胞的酰胺酶活性低，所以含量较高，博莱霉素水解失活少，常蓄积导致不良反应，故成为诱导动物PF模型的常用药物之一[10]。虽然3种模型的损伤机制不同，但相关细胞因子的病理变化、过程及其分子调控机制与人PF相似。因此，本论文构建二氧化硅、百草枯、博莱霉素诱导的大鼠PF模型，采用iTRAQ结合LC-MS/MS质谱分析，整体分析3种大鼠PF模型与正常肺组织之间的共同差异表达蛋白，以期寻找与PF相关的关键蛋白。研究发现将为阐明PF形成机制奠定重要的理论和实验基础，并为PF的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 大鼠PF模型建立方法随机选取48只SD大鼠(购自河南省实验动物中心)，分为6组：二氧化硅模型组(n=8)和二氧化硅对照组(n=8)：二氧化硅模型组用质量分数10%水合氯醛(0.3 mL/kg)麻醉大鼠，于气管软骨环间隙穿刺，每只大鼠注入二氧化硅悬液0.2～0.3 mL(5 mg/kg)；百草枯模型组(n=8)和百草枯对照组(n=8)：百草枯模型组大鼠一次性给予百草枯50 mg/kg灌胃染毒造模；博莱霉素模型组(n=8)和博莱霉素对照组(n=8)：博莱霉素模型组用质量分数10%水合氯醛(0.3 mL/kg)麻醉大鼠，于气管软骨环间隙穿刺，每只大鼠注入盐酸博莱霉素5 mg/kg；3个对照组分别以与相应模型组相同方法注射或灌胃相同体积生理盐水。待动物自然清醒后进行常规饲养。各组大鼠在给药后第28天处死，完整分离每只大鼠的双侧肺组织样品。

1.2 肺系数计算及羟脯氨酸含量测定方法将分离得到的大鼠双侧肺组织用生理盐水冲洗干净，用滤纸吸除肺组织样品表面的水分，称量肺湿质量。肺系数计算公式：肺系数=肺湿质量(mg)/大鼠体质量(g)。取右肺中叶组织称重，剪碎后冰浴中匀浆，用羟脯氨酸试剂盒(购自南京建成生物公司)测定肺组织样品中羟脯氨酸含量，测定方法按试剂盒说明进行。

1.3 肽段酶解及标记方法提取肺组织蛋白样品定量后分别取200 μg蛋白溶液置于离心管中，用iTRAQ试剂盒(美国AB Sciex公司)进行酶解，酶解后的肽段样品用四标iTRAQ试剂盒(美国AB Sciex公司)进行标记。为了确保标记的效率及定量准确性，从6组样品中各取出1 μL混合用于检测，先用Ziptip进行样品脱盐处理，再用MALDI-TOF-TOF进行质谱鉴定，然后将标记的样品真空干燥储存。

1.4 肽段离线预分离及蛋白质分析在色谱柱(Durashell-C18, 4.6 mm×250 mm, 5 μm, 100 Å)中加入酶解好的牛血清白蛋白400 μg进行分离(柱温45 ℃)，检测系统的运行状况(检测波长214 nm)。在上述酶解标记的肽段混合样品中加入100 μL流动相A[98%双蒸水、体积分数2%乙腈(pH 10.0)]充分溶解，14 000 g离心20 min，取100 μL上清样本上样，流速为0.7 mL/min。预分离的蛋白肽段样品组分应用高效液相色谱仪和质谱系统进行蛋白质分析。分离梯度设置见表1。

1.5 质谱数据分析方法本研究iTRAQ质谱分析产生的原始文件采用美国Thermo公司的配套软件Proteome Discoverer 1.3处理。根据原始数据的P值，选取P≤0.05进行过滤，分别在二氧化硅组、百草枯组、博莱霉素组上下调差异倍数≥1.5中，寻找3种PF模型同时上调和下调所得蛋白列表进行进一步生物信息学分析。使用DAVID数据库对差异表达蛋白质进行全面的生物学功能注释，获取与差异表达蛋白质所有相关的功能信息。

表1 蛋白肽段分离梯度设置

2 结果

2.1 大鼠PF模型的复制及造模评估结果本研究分别建立了二氧化硅、百草枯、博莱霉素诱导的大鼠PF模型。与相应对照组比较，3个模型组大鼠的肺组织结构破坏严重，肺泡腔多发生塌陷，肺泡间隔显著增宽，炎性细胞浸润增多，胶原沉积及大量纤维组织增生。与相应对照组比较，3个模型组肺组织样品多呈3级纤维化和2级肺泡炎改变，肺泡炎评分显著提高，差异均有统计学意义(t二氧化硅组=43.929，P<0.001；t百草枯组=44.507，P<0.001；t博莱霉素组=32.156，P<0.001)。与相应对照组比较，3个模型组的PF评分也明显提高，差异均有统计学意义(t二氧化硅组=51.479，P<0.001；t百草枯组=47.591，P<0.001；t博莱霉素组=43.453，P<0.001)。与相应对照组比较，3个模型组大鼠肺系数明显增高，差异均有统计学意义(t二氧化硅组=58.016，P<0.001；t百草枯组=61.497，P<0.001；t博莱霉素组=24.093，P<0.001)。与相应对照组比较，3个模型组大鼠肺组织羟脯氨酸含量明显增加，差异均有统计学意义(t二氧化硅组=12.759，P<0.001；t百草枯组=3.770，P=0.001；t博莱霉素组=7.131，P<0.001)。见图1，表2、3。

2.2 肽段的质量准确度评估结果在全扫描范围内，大部分的离子偏差值都在±10 ppm范围内，测得的肽段质量数据偏差较小且稳定，说明了仪器测定的稳定性及准确度都较高。如质荷比大部分分布在350～1 200，肽段存在的形式多以2+、3+和4+电荷及以上，肽段相对分子质量分布在1 000～2 500，表明样品酶解效果好，仪器能测定大多数的肽段信息。

2.3 3种PF模型蛋白差异表达谱本研究应用iTRAQ技术对二氧化硅、百草枯、博莱霉素所致大鼠PF模型进行了蛋白组学研究。经过iTRAQ标记联合LC-MS/MS质谱技术鉴定，由统计图的各点进行定量分析后，根据其在114(对照组)、115(二氧化硅模型组)、116(百草枯模型组)、l17(博莱霉素模型组)标签峰的峰面积比值，我们选取了以114作为对照，115、116、117与之进行比较。根据原始数据的P值，选取P≤0.05进行过滤，分别在二氧化硅组、百草枯组、博莱霉素组上下调差异倍数≥1.5中，对所得结果进行分析。3种模型的差异蛋白比较发现，共同的差异表达蛋白有57个，其中上调蛋白21个，下调蛋白36个，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表4。

图1 3种大鼠PF模型肺组织HE染色鉴定结果图

表2 3种大鼠PF模型肺泡炎与PF评分比较

表3 二氧化硅、百草枯、博莱霉素PF模型肺系数及羟脯氨酸含量

表4 3种大鼠PF模型的差异蛋白比较

续表4

续表4

3 讨论

PF是由多种肺部损伤引起的，包括毒性、自身免疫性、药物诱导、感染性或创伤性损伤。PF形成的诱因和病理是由于ECM过度沉积，ECM的主要成分是胶原蛋白，而羟脯氨酸作为胶原蛋白中一种特有的氨基酸，当胶原蛋白代谢发生异常时，组织内羟脯氨酸含量会发生相应的变化[7]，因此肺组织肺系数和羟脯氨酸含量结果可以证明二氧化硅、百草枯和博莱霉素PF造模成功与否。本研究运用iTRAQ技术结合LC-MS/MS质谱分析发现，二氧化硅、百草枯、博莱霉素PF模型之间的共同的差异蛋白有57个，其中上调蛋白21个，下调蛋白36个。并发现这些差异蛋白主要与ECM受体相互作用，如发现整合素3、凝血酶敏感蛋白1表达改变都与ECM沉积有关，这也证明了PF过程主要为ECM沉积所致。另外，对于溶酶体通路富集，组织蛋白酶Z、组织蛋白酶S等与溶酶体相关蛋白大量表达，说明PF过程与肺泡炎相关。如果能消除炎性介质，稳定溶酶体，减少炎性细胞因子的释放可能对肺损伤有保护作用，也有利于延缓PF发生、发展过程。肺泡巨噬细胞分泌的血小板衍生生长因子以及血小板的激活对肺纤维化多种病理病变过程有着重要影响，我们的研究发现，在差异表达蛋白中血小板糖蛋白Ⅰb α链前体、血小板糖蛋白Ⅰb β链前体、血小板碱性蛋白前体、血小板因子4前体、血小板糖蛋白VX1亚型、血小板糖蛋白IX前体均参与肺纤维化形成。另外，这些差异蛋白也与细胞免疫应答有关，如多肽5样亚型X11、X5等；也可能与信号转导有关，如糖蛋白、载脂蛋白等。研究[11-12]表明，血红素氧合酶1、碱性成纤维细胞生长因子均参与肿瘤细胞的生长和凋亡以及新生血管生成等细胞过程，可作为肿瘤标志物。除了本研究中不同PF模型组中检测到的差异蛋白，后续可以研究一些肿瘤相关标志物是否也可以作为肺纤维化的检测指标。

综上所述，本研究采用iTRAQ联合LC-MS/MS检测技术筛选出3种PF模型中多个差异表达蛋白，为深入探讨PF的发病机制提供了新的研究方向。