谢 云 郭芳芸 陈丽华 曹 兵
(宁夏大学农学院 银川 750021)
据IPCC报告(赵宗慈等, 2018),2011年达到390.5 μmol·mol-1,设在美国夏威夷莫纳罗阿岛上的测量站测得的数据显示(Wangetal., 2019),2018年5月大气中CO2浓度达到415 μmol·mol-1。大气 CO2浓度升高已经成为全球关注的热点问题之一。CO2浓度升高主要通过影响植物的生长进而间接影响土壤微生物的群落和结构,会引起植物-土壤-微生物群落以及整个陆地生态系统的功能性改变(Rieretal., 2005;Delgado-Baquerizoetal., 2017)。
土壤是自然界物质循环的重要基地,而土壤微生物是土壤的重要组成之一(Muelleretal., 2018)。土壤微生物多样性在维持多种生态系统功能方面起着重要作用,如固氮作用、硝化反硝化作用、腐殖质分解和合成作用以及养分循环和对温室气体排放的调节作用(McFarlandetal., 2013; Williamsetal.,2000; 徐国强等, 2002)。因此,了解土壤微生物多样性及其活动状况具有重要意义,但是目前有关土壤微生物群落在全球气候变化环境背景下的驱动因素、变化规律和机制尚需深入研究。
大气-植物相互影响方面已有诸多研究,如高CO2浓度对水稻(Oryzastiva)(Terrer, 2018)、黑麦草(Loliumperenne)(马红亮等, 2010)等的光合碳分配产生影响,从而使植物叶片中碳的增幅最显著,其次为根、茎; 但对地下以及与地上部分之间的耦合关系的研究少有报道,特别是微生物主导的碳氮循环过程对全球气候变化的反馈机制仍是研究的难点之一。大气CO2浓度升高对于草本植物土壤微生物群落影响的研究较多((Dijkstraetal., 2011; Rilligetal., 1998; 王立, 2006),而对于木本植物土壤微生物群落及功能多样性的研究较为缺乏。
宁夏枸杞(Lyciumbarbarum)为茄科(Solanaceae)枸杞属多年生落叶灌木(牛燕,2005),具有适应性强、果实营养价值高、药理作用明显的特点,是典型的药食同源植物(刘赛等, 2019),在宁夏、甘肃、山西、内蒙古、山西、河北等地均有分布和栽培(徐常青等, 2014; 马海军等, 2015), 其中以‘宁杞1号’品种栽培面积最大。前期研究发现,大气CO2浓度升高对宁夏枸杞果实糖类、代谢产物及调控糖代谢基因产生影响,总糖、类胡萝卜素含量显著下降,黄酮含量显著升高,糖代谢基因显著上调,表明CO2浓度升高对宁夏枸杞生理代谢产生显著影响(Maetal., 2019; 哈蓉等, 2019)。目前对宁夏枸杞根际微生物功能调控方面未有报道。本研究利用BIO-ECO生态板技术(Zhangetal., 2014)对不同CO2浓度的宁夏枸杞根区土壤微生物群落以及土壤微生物对不同碳源的代谢能力进行研究与分析,旨在揭示随着CO2浓度的增加,不同时期宁夏枸杞土壤微生物对碳源的利用特性以及土壤微生物的动态变化规律,为揭示枸杞栽培土壤微生物群落对气候变化的响应提供参考与依据。
1.1 试验材料与设计 试验于2019年3—10月在宁夏大学实验农场进行,供试材料为宁夏枸杞‘宁杞1号’1年生扦插苗。
本试验为单因素设计,设置自然环境大气CO2浓度[CK,(400±20) μmol·mol-1]、0.5倍增大气CO2浓度[TR1,(600±20) μmol·mol-1]、1倍增大气CO2浓度[TR2,(800±20) μmol·mol-1]3个处理,每处理设3次重复,采用开顶气室(open-top chamber,OTC)来控制模拟CO2浓度水平(马亚平等, 2019),共9个气室,每气室种植9株‘宁杞1号’扦插苗。自2019年5月起,对气室进行CO2通气处理(每日8: 00—20: 00,共12 h)(郭芳芸等, 2019)。
1.2 土壤样品采集 CO2通气处理后30,60,90,120天在各气室内采用五点取样法取0~40 cm土样,48 h内进行BIOLOG功能多样性分析,试验处理前取样测定做样地土壤理化性质分析(表1)。
表1 各样地土壤基本理化性质①Tab.1 Soil physical and chemical properties of samples
1.3 土壤微生物功能多样性测定 BLO-ECO微平板接种方法(曹宏杰等, 2019),将接种好的微平板置于25 ℃恒温箱进行培养,每隔12 h用酶标仪读取590 nm下的吸光度,连续测定7天。
微生物整体活性指标采用微平板每孔颜色平均变化率(average well color development,AWCD)来描述(邓娇娇等, 2018),Shannon,Simpson,McIntosh等多样性指数计算公式如下:
平均吸光度AWCD:
AWCD=∑(Ai-AA1)/31。
式中:Ai为第i孔的吸光值,AA1为A1孔的吸光值,Ai-AA1为负值时则归0。
Shannon指数H′:
H′=-∑Pi×ln(Pi) ;
Simpson指数D:
式中:Pi为第i孔的相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比率。
McIntosh指数U:
式中:ni为第i孔的相对吸光值。
McIntosh均一度E:
式中:N为相对吸光值的总和,S为发生颜色变化的孔的数目。
1.4 数据处理与分析 采用Excel软件进行数据计算与整理,数据利用IBM SPSS Statistics 21.0进行单因素方差分析、Duncan多重比较,数据以均值±标准误进行统计。利用Origin2018进行主成分分析并作图。
图1 CO2浓度升高处理下宁夏枸杞根区土壤微生物 AWCD值随培养时间的变化Fig. 1 Changes of soil microorganism AWCD in root zone of wolfberry under elevated CO2 with culture time A:处理30天时AWCD值变化AWCD value change of treatment for 30 d; B: 处理60天时AWCD值变化AWCD value change of treatment for 60 d; C: 处理90天时AWCD值变化AWCD value change of treatment for 90 d; D: 处理120天时AWCD值变化AWCD value change of treatment for 120 d.
2.1 大气CO2浓度升高对宁夏枸杞根区土壤微生物群落代谢活性的影响 BIO-ECO生态板的平均颜色变化率(average well color development,AWCD)是指通过土壤微生物对碳源的代谢过程中产生的酶与显色物质发生颜色反应变化来表现出土壤微生物群落的整体活性,也表示对各种碳源的整体利用情况(党雯等, 2015)。由图1可知,AWCD值随着培养时间的增加迅速升高,生长趋势呈“S型”增长,表明土壤微生物在不断利用碳源,直到培养至144 h 后变化趋于平缓,说明宁夏枸杞根区土壤微生物群落在36~144 h培养时间内代谢活性最强。不同CO2浓度处理之间土壤微生物活性具有差异,土壤微生物群落代谢活性变化的总趋势为: 自然环境大气CO2浓度<0.5倍增CO2浓度<1倍增CO2浓度,说明在3个处理中1倍增CO2浓度处理下的土壤微生物群落具有最强的代谢能力。
由图2可知,在CO2通气处理30、60、90、120天时,AWCD的曲线高度从自然环境CO2浓度、0.5倍增CO2浓度、1倍增CO2浓度依次升高,且呈递增趋势。其中处理60天时的AWCD值均为最高,表明其对碳源的利用量最多,微生物代谢活性最强,处理90天时次之; 而处理120天时宁夏枸杞根区土壤微生物代谢活性最弱。宁夏枸杞根区土壤微生物群落在7月(处理60天)活性最强,9月(处理120天)活性最弱。
图2 CO2浓度升高处理下宁夏枸杞根区土壤 微生物的活性随处理时间的变化Fig. 2 Changes of soil microbial activity in the root zone of wolfberry under the treatment of elevated CO2 with treatment time
2.2 大气CO2浓度升高对宁夏枸杞根区土壤微生物群落功能多样性指数的影响 多样性指数越大则表明,土壤微生物群落多样性越高(王超群等, 2019)。由表2可知,不同CO2浓度处理之间土壤微生物群落代谢活性差异显著,对碳源利用能力的顺序为1倍增大气CO2浓度>0.5倍增浓度>自然环境浓度; 而土壤微生物物种丰富度Shannon 指数、优势度Simpson指数均为1倍增浓度>0.5倍增浓度>自然环境浓度,但是1倍增和0.5倍增大气CO2浓度处理之间无显著差异,但均显著高于对照。McIntosh 指数为1倍增浓度>0.5倍增浓度>自然环境浓度,0.5倍增相比于1倍增CO2浓度差异不显著。以上结果表明,1倍增CO2浓度宁夏枸杞根区土壤微生物群落多样性显著高于自然环境CO2浓度。
根据处理时间的差异来看,宁夏枸杞根区土壤微生物群落均匀度指数McIntosh变化趋势与物种丰富度指数Shannon相似,整体呈现“先上升后下降”的趋势。处理60天和90天时McIntosh 指数最高,处理120天时 McIntosh 指数最低,Simpson指数除处理60天时无显著差异,其他时间段均有显著差异。
2.3 大气CO2浓度升高处理下宁夏枸杞根区土壤微生物群落碳代谢指纹图谱分析 BIO-ECO微平板共具有31种碳源,其中主要分为单糖、糖苷、聚合糖等糖类,氨基酸类,酯类,醇类,胺类以及酸类6大类(钱明媚,2015)。根据不同CO2浓度处理的宁夏枸杞根区土壤微生物群落对6大类碳源的利用程度进行分析,由图3可知,土壤微生物利用率较大的碳源主要为氨基酸类、酯类和胺类,而糖类和酸类利用率较低,说明氨基酸类、酯类和胺类是宁夏枸杞根区土壤微生物群落利用并转化的主要碳源。
AWCD>1.5的碳源,自然环境大气CO2浓度处理有12种碳源,占总碳源数的38%; 0.5倍增CO2浓度处理有11种,占总碳源数的35.48%; 而1倍增CO2浓度则具有17种,占总碳源数的54.84%,说明大气CO2浓度升高土壤微生物群落对于碳源的利用类型增多。不同大气CO2浓度处理下土壤微生物群落对L-天冬酰胺酸、D-甘露醇、L-丝氨酸、L-天冬酰胺酸、乙基胺、4-羟基苯甲酸和吐温-40的利用强度较大。1倍增大气CO2浓度处理下,土壤微生物群落对L-精氨酸、L-天冬酰胺酸、吐温-40、苯乙基胺和4-羟基苯甲酸等的利用代谢能力显著高于对照,而自然环境大气CO2浓度下土壤微生物群落对于γ-羟基丁酸的利用代谢能力显著高于CO2升高的处理。
表2 CO2浓度升高下土壤微生物功能多样性指数Tab.2 Functional diversity index of soil microbes under elevated CO2
2.4 大气CO2浓度升高处理下宁夏枸杞根区土壤微生物群落代谢多样性类型主成分分析 在BIO-ECO生态板中,碳源在主成分上的载荷值越高,则表示该种碳源对主成分的影响越大。如表3所示,对主成分1( PC1) 贡献率大的碳源10种,其中,糖类1种,氨基酸类2种,酯类2种,醇类1种,酸类3种,与 PC1正相关程度最高的碳源为D-氨基葡萄糖酸(0.238),L-苯基丙氨酸(0.237)次之。对主成分2( PC2) 贡献率大的碳源为2种糖类碳源,分别是β-甲基-D-葡萄糖苷和α-D-乳糖,与PC2 正相关程度最高的碳源为β-甲基-D-葡萄糖苷(0.243)。利用PC1和PC2主成分将不同时期下土壤微生物群落划分而起分异作用的主要碳源是糖类和胺类,这可能是植株、土壤养分与土壤特征微生物等相互作用的结果。
利用培养144 h的AWCD值,对3个处理和4个处理时期的土壤微生物碳源利用特性进行主成分分析(图4),其中β-甲基-D-葡萄糖苷、D-木糖和N-乙酰基-D-葡萄胺3种碳源主成分累计贡献率为31.0%,其中4个时期的PC1方差贡献率分别为72.95%,63.84%,66.00%,63.96%; PC2的方差贡献率分别为27.05%,36.12%,34.00%,36.04%。
由图4和表3可知,30 d-PC1正轴方向分布的0.5倍增和1倍增大气CO2浓度,碳源利用主要为氨基酸类、酯类和酸类,在30 d-PC2正轴方向分布的1倍增和自然环境大气CO2浓度,6类碳源均有利用,其中酯类利用率最高。60 d-PC1正轴方向分布的自然环境和1倍增CO2浓度,利用的碳源主要为糖类、酯类和酸类,在60 d-PC2正轴方向分布的为1倍增CO2浓度,主要利用酯类和酸类。90 d-PC1正轴方向为1倍增CO2浓度,碳源均有利用,而90 d-PC2正轴方向则为0.5倍增和自然环境CO2浓度,前者主要利用酯类碳源,而后者则为氨基酸类碳源,其他碳源利用类似。处理120天同处理90天。
表3 CO2浓度升高处理下宁夏枸杞根区土壤微生物PC1、PC2的碳源主成分载荷因子Tab.3 Carbon sources loading factors of PC1 and PC2 of PCA in the root zone of wolfberry under elevated CO2
图4 CO2浓度升高处理下宁夏枸杞根区土壤微生物碳源利用主成分分析Fig. 4 Principal component analysis of carbon source utilization in the root zone of wolfberry under elevated CO2
土壤微生物功能多样性是指土壤微生物群落所能执行的功能范围以及这些功能的执行过程,例如分解、营养传递以及促进或抑制植物生长的功能(贾夏等, 2013; 雷霆等, 2007)。本研究表明,大气CO2浓度的增加对土壤微生物群落的活性产生显著影响,这与徐国强等(2002)和Williams等(2000)的研究结果相似,但与Ronn等(2002)和Carrillo等(2018)认为的CO2浓度升高对微生物群落结构影响不显著的结果不同。从理论上来说,自然环境大气CO2浓度分直接和间接来影响土壤微生物群落的活性和变化,直接影响主要为植株通过光合作用将CO2同化成有机物并将其运输至根系(王苑,2014),根系通过分泌和死亡的方式将更多的营养和能源供给微生物群落,从而引起土壤微生物分解速率和活性增强,生物量增加; 而土壤呼吸作用、土壤理化性质、植物凋落物数量等都是影响微生物群落活性和变化的间接因素(Dijkstraetal., 2011)。Williams等(2000)研究表明,自然环境大气CO2浓度的增加会影响植物叶片某些化学成分的变化(非结构C的增加),从而导致叶片中其他物质含量的变化,主要为N含量的减少和次生代谢物质的增加,导致植物凋落物组成成分发生变化,碳氮比增加,土壤微生物分解活动增大,导致土壤微生物活性的增大。
土壤中 CO2浓度远远高于自然环境大气中的浓度,大气 CO2浓度的升高会引起土壤中碳源供应能力、水分和养分有效性发生变化,能显著影响土壤微生物的群落和功能,土壤微生物群落的变化不仅与植物和土壤中的养分有关,而且与温度、空气、湿度及其他因素有着一定的联系(Zaketal., 2000)。Liu等(2017)研究指出,土壤中细菌的数量级远远大于真菌,在有机物转化的过程中占有相当大的比重,对于根周转加速、根系分泌物的分解转化等养分循环起着重要作用。物种多样性指数是表征土壤中微生物群落的物种丰富度及其优势物种度和分布均匀程度的常用指数,其中最常见的3种指数为Shannon指数、Simpson指数和McIntosh指数,分别从不同角度反映土壤微生物群落的功能多样性(邓娇娇等, 2018)。从上述分析可以得出,大气CO2浓度升高能使土壤微生物群落的物种丰富度、物种优势度及群落均匀度增加,但是随着处理时间的增加,不同CO2浓度处理间土壤微生物的物种优势度逐渐减小,这可能是由于土壤微生物群落到处理后期对高浓度CO2具有了适应能力。目前,国内外利用BIO-ECO板来分析微生物群落的多样性的同时,很少考虑培养条件、培养时间以及样品处理等因素,其中,贾夏等(2013)、党雯等(2015)发现培养时间和样品预处理的不同在多样性指数、碳源利用率均存在着差异。
在整个研究过程中,宁夏枸杞根区土壤微生物群落所利用的碳源主要为氨基酸类、酯类和胺类,而对糖类和酸类利用率较低。氨基酸类为土壤有机氮的主要来源,植物无法直接利用含氮有机物中的氮素,必须先经过微生物分解之后才能吸收;酯类和胺类则为土壤中最重要的有机成分(杨美玲等, 2018)。这一结果可能与宁夏枸杞根系分泌物具有一定的关系。根据Zak等(2010)关于CO2浓度升高对植物影响的47个研究进行综合分析显示,CO2浓度升高会对植物生产力,植物根系有机酸、可溶性糖和有机酸等化合物的分泌有着巨大的改变,从而改变土壤微生物群落,使其提高土壤和微生物的呼吸速率。在31种碳源中,β-甲基-D-葡萄糖苷、D-木糖和N-乙酰基-D-葡萄胺3种碳源是大气CO2浓度升高后导致土壤微生物群落变化的敏感碳源。土壤微生物代谢功能类群有不同的碳源利用能力,植物的根系分泌物不同,所以导致其土壤微生物所利用的碳源也有所不同。
综上所述,大气CO2浓度升高可促进宁夏枸杞根区土壤微生物功能多样性,可提高其碳源利用率,并改变部分碳源利用类型。本研究为宁夏枸杞根区土壤微生物在气候变化背景下的受大气CO2浓度升高影响提供了一部分生理生化信息,为宁夏枸杞的培育和田间管理提供一定理论参考和技术支撑。
通过大气CO2浓度升高对宁夏枸杞1个生长季土壤微生物群落功能多样性的研究,可获得以下结论: 1倍增大气CO2浓度处理宁夏枸杞根区土壤微生物群落对31种碳源的平均利用率和4种多样性指数均最高,自然环境大气CO2浓度处理最低。宁夏枸杞根区土壤微生物群落对氨基酸类、酯类和胺类碳源利用率较高,而糖类和酸类利用率较低,说明氨基酸、酯类和胺类碳源是宁夏枸杞根区土壤微生物群落利用并转化的主要碳源。
大气CO2浓度升高均能使微生物群落的活性及碳源利用率明显增加,随着处理时间的延长,土壤微生物群落活性逐渐增强直至处理60天(7月份)后减弱,处理120天(9月份)时宁夏枸杞根区土壤微生物群落活性最弱。根据宁夏地区的气候条件分析,这可能与微生物群落对于温度较高、湿度较高的环境适应力较高有关,尤其细菌。