超声辅助酶法提取米渣中蛋白的研究

王真真，史晶晶，汪姣蓉，陈嘉辉，王华南，章 焰，刘爱红，陈 洁

（湖北大学知行学院粮食与食品工程学院，湖北武汉 430011）

米渣是味精、淀粉糖、有机酸生产的副产物，在生产淀粉糖的过程中，当7 t 大米被用来制作淀粉糖时就会有1 t 的米渣产生。在工业制糖的过程只是利用了大米当中的淀粉，副产品米渣中还含有大米蛋白，其米渣中蛋白质的含量高达40%～70%，称作大米蛋白浓缩物（Rice protein concentrate，PRC） 俗称米渣蛋白，其中大米蛋白含量可达到80%[1]。大米蛋白由于其较高的生物价、低抗原性、氨基酸组成合理、易于消化等特点，成为大米深加工的新方向[2]。然而，米渣蛋白在经过长时间的高温液化后，蛋白发生变性，结构发生了变化，溶解性也降低，其在食品方面的应用受到了很大限制，大部分的米渣经过干燥后被用作饲料，使残留在米渣中的蛋白质未得到开发。大米蛋白由于其较高的生物价、低抗原性、氨基酸组成合理、易于消化等特点，成为大米深加工的新方向[3]。

大米蛋白是优质谷物蛋白，非常符合WHO/FAO推荐的理想模式[4]。大米蛋白的结构特点赋予了其持水、乳化、起泡等特性，如国内外有研究人员利用米渣蛋白生产发泡粉[5-6]，大米蛋白除作为蛋白饲料外，可应用于食品添加剂。还有研究者发现，大米蛋白在降低胆固醇、预防慢性疾病、抗癌变、促进免疫等方面发挥了很大作用[7-9]。

一般是从精米或者碎米中提取米粉加工成淀粉，而残留的蛋白质则被认为是价值有限的副产品。近年来，大米蛋白的营养和健康特性得到广泛的认可，使得一些研究者对这些成分越来越感兴趣，转而展开对大米蛋白的提取、浓缩、纯化和功能性产品的研究[10]。稻谷在加工时的各项副产物，均能用来提取大米蛋白，国内研究较多的主要是米胚和碎米，由于米渣的高蛋白质含量开始渐渐引起研究者的关注[11]。大米蛋白主要是4 类蛋白质：水溶性的清蛋白、盐溶性的球蛋白、醇溶蛋白、酸溶或者碱溶性的谷蛋白。其中，谷蛋白占到总蛋白含量的80%以上，是这几种蛋白中占比最高的一种[12]。针对这几种蛋白的特性，目前国内外比较常用的提取方法主要是酶法提取、碱法提取、溶剂提取法、物理分离法及将2种或者多种方法结合起来的复合提取法等[13]。碱法的提取工艺简单、成本低廉、提取率高，然而在反应过程需要消耗大量的碱液和酸液，淀粉和蛋白质的结构性质在强酸强碱的影响下会产生有害变化，会导致发生氨基酸缩合反应而引起有毒有害物质的生成，并伴随着褐色物质的产生，影响产品的外观色泽[14]。排杂法是通过去除米渣中各种非蛋白组分，如油脂、纤维素、淀粉等糖类物质，从而提高剩余物中蛋白的比例，得到高纯度的大米蛋白，但其提取的操作十分复杂[15]。酶法提取米渣蛋白的原理是利用蛋白酶的内切或者外切作用对蛋白质进行切割，使其水解成为可溶性的短肽，之后通过离心分离和干燥得到大米蛋白[16]。使用蛋白酶法提取的优点是提取的蛋白质营养价值高，人体能够较好地消化吸收其水解得到的短肽，不会产生有毒有害物质，并且提取条件十分温和。米渣中蛋白因在水中的溶解性较差，常规酶解方法只能使50%的大米蛋白溶解[17]。而超声预处理是利用超声波的能量来改变物质组织结构、状态、功能，并且超声能量能够作用于酶分子，使酶分子的构象改变，影响其催化活性[18]。酶的构象因适宜的超声改变，使酶的活性中心充分暴露，增加底物与之结合的机会，加快反应过程[19]。超声波具有明显的空化效应，适用于乳化、结晶、均质、水解、生物活性物质提取等许多食品加工过程[20]。

采用超声辅助酶法提取工艺，以米渣为大米蛋白提取原料，研究超声对米渣蛋白提取效率的影响，优化米渣蛋白的提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

食品级碱性蛋白酶（酶活力单位200 000 U/g），浙江安详生物科技有限公司提供；硫酸铜、硫酸钾、硫酸、硼酸、氢氧化钠、盐酸等，以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FA1104 型分析天平，上海精科天平有限公司产品；SH A-B 型双功能水浴恒温振荡器，常州国华电器有限公司产品；TG16G 型台式高速离心机，常州市金坛高科仪器厂产品；UP 型超声波清洗仪，南京垒君达超声电子设备有限公司产品；KDN-04A 型蛋白质测定仪，上海洪记仪器设备有限公司产品；D2X-6020B 型真空干燥箱，上海福玛实验设备有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 蛋白质的测定方法

参照GB 5009.5—2016 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定。

1.3.2 超声对米渣蛋白提取率的影响

称取4 份相同米渣样品，分别标记为I，II，III，IV。II 号样品料液比1∶6，加酶量1 200 U/g，酶解温度40 ℃；

III 号样品料液比1∶6，超声处理40 min；IV号样品料液比1∶6，加酶量1 200 U/g，酶解温度40 ℃，超声处理40 min；I 号样品不加酶，不适用超声处理，作为空白对照。以上I～IV 号样品按上述方法提取米渣蛋白后，采用凯氏定氮测定蛋白质含量。

1.3.3 超声辅助碱性蛋白酶提取米渣蛋白工艺

称取米渣→加酶→调pH 值→水浴振荡→超声处理→灭酶→离心分离→上清液干燥→测定蛋白质含量。

根据料液比将碱性蛋白酶溶于定量的去离子水，微热并搅拌使其充分溶解，冷却至室温后待用。酶液中加入3.00 g 米渣，调pH 值至8.5，50 ℃下水浴振荡超声处理，80 ℃下灭酶15 min。然后离心，将离心的沉淀用20 mL 的去离子水洗涤，相同转速下二次离心，收集并合并2 次上清液，调节pH 值至中性，烘箱干燥。

1.3.4 超声辅助碱性蛋白酶提取米渣蛋白工艺优化

（1） 料液比对米渣蛋白提取率的影响。料液体积比分别选取1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，加酶的量1 200 U/g，酶解温度50 ℃，酶解pH 值8.5，酶解时间100 min，超声时间40 min。后续提取测定步骤同1.3.3，考查不同料液比对米渣蛋白提取率的影响。

（2） 加酶量对米渣蛋白提取率的影响。料液比1∶6，加酶量分别选取1 200，1 350，1 500，1 650 U/g，酶解温度50 ℃，酶解pH 值8.5，酶解时间100 min，超声时间40 min。后续提取测定步骤同1.3.3，考查不同加酶量对米渣蛋白提取率的影响。

（3） 酶解温度对米渣蛋白提取率的影响。料液比1∶6，加酶量1 200 U/g，酶解温度分别选取50，55，60，65 ℃，酶解pH 值8.5，酶解时间100 min，超声时间40 min。后续提取测定步骤同1.3.3，考查不同酶解温度对米渣蛋白提取率的影响。

（4） 酶解时间对米渣蛋白提取率的影响。料液比1∶6，加酶量1 200 U/g，酶解温度50 ℃，酶解pH 值8.5，酶解时间分别选取100，120，140，160 min，超声时间40 min。后续提取测定步骤同1.3.3，考查不同酶解时间对米渣蛋白提取率的影响。

（5） 超声时间对米渣蛋白提取率的影响。料液比1∶6，加酶量1 200 U/g，酶解温度50 ℃，酶解pH 值8.5，酶解时间100 min，超声时间分别选取40，60，80，100 min。后续提取测定步骤同1.3.3，考查不同超声时间对米渣蛋白提取率的影响。

（6） 正交试验设计优化米渣蛋白的提取工艺参数。在单因素试验的基础上，通过设计正交试验优化米渣蛋白提取工艺参数。以料液比、加酶量、酶解时间、酶解温度及超声时间为5 个因素，以蛋白质的提取率为指标，采用L16（45）进行正交试验。

正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计

2 结果与分析

2.1 超声处理对米渣蛋白提取率的影响

超声处理对米渣蛋白提取率的影响见图1。

图1 超声处理对米渣蛋白提取率的影响

由图1 可知，无论是单独的碱性蛋白酶作用还是超声波单独处理均有助于对米渣蛋白提取。酶法提取主要是使用蛋白酶的降解和修饰作用使其成为可溶性肽，然后提取出来。酶法提取反应条件温和、料液比小、固形物含量高，能减少去除提取液水分的能量消耗[21]。酶法提取还可能产生具有多种活性的生物肽和氨基酸[22-23]。与超声预处理比较，超声波与酶协同处理对米渣蛋白纯度的影响更大。底物可以通过超声波在介质中形成的微流效应快速进入催化部位，并让其构象发生改变，使其折叠更合理，便于与底物进行结合，从而影响酶促反应进程，提高酶的催化效率。超声处理在米糠蛋白的提取上也得到了应用[24]。超声还广泛应用于辅助碱法提取米渣蛋白[25]。

2.2 提取工艺条件对米渣蛋白提取率的影响

2.2.1 料液比对米渣蛋白提取率的影响

料液比对米渣蛋白提取率的影响见图2。

图2 料液比对米渣蛋白提取率的影响

由图2 可知，料液比为1∶6 ～1∶10 时，提取率逐渐升高，当料液比达到1∶10 时不再升高而略有下降。当料液比值较大时，提取液黏度大，分子扩散速率降低降低，不利于超声波的传导，影响蛋白酶提取物的释放[22，26]。增加提取液的体积，有利于提高碱性蛋白酶与大米蛋白相互作用的机率及对大米蛋白的降解和修饰作用。料液比值过小时，提取率降低，会增加后续对提取液处理的成本。

2.2.2 加酶量对米渣蛋白提取率的影响

加酶量对米渣蛋白提取率的影响见图3。

图3 加酶量对米渣蛋白提取率的影响

由图3 可知，在加酶量＜1 500 U/g 时，随着酶的添加量的增加，蛋白提取率的增高。当加酶量＞1 500 U/g 时，提取率减小。一般情况下在pH 值、温度和底物浓度一定时，酶促反应速率正比于酶浓度。酶在特定的蛋白质分子上的作用位点的数量是有限的，当添加的酶量达到一定量后，酶与底物的作用位点到达饱和，再增加酶的用量提取率影响不大。

2.2.3 酶解温度对米渣蛋白提取率的影响

酶解温度对米渣蛋白提取率的影响见图4。

图4 酶解温度对米渣蛋白提取率的影响

由图4 可知，随着温度的升高，米渣蛋白的提取率增加；当酶解温度达到50 ℃时，米渣蛋白的提取率达到最高值；当温度超过50 ℃时，米渣蛋白的提取率呈现下降趋势。蛋白酶发生作用温度范围为40～50 ℃。温度对酶催化反应速率的影响是双重的：在低的温度范围内随温度提高，反应速率加快；当温度超过50 ℃时碱性蛋白酶的活性降低，温度过高甚至使酶失去活性。

2.2.4 酶解时间对米渣蛋白提取率的影响

酶解时间对米渣蛋白提取率的影响见图5。

图5 酶解时间对米渣蛋白提取率的影响

由图5 可知，米渣蛋白的提取率与酶解时间呈现正相关。140 min 之前，底物浓度高酶解速度快，随着酶解时间的延长，提取率缓慢升高。140 min 后米渣蛋白的提取率略微降低。

2.2.5 超声时间对米渣蛋白提取率的影响

超声时间对米渣蛋白提取率的影响见图6。

由图6 可知，当超声时间为40～80 min 时，随着超声时间的增加，蛋白质的提取率也在提高，当超过80 min 时，蛋白质提取率略有下降。适宜的超声能量能够改变酶的构象，当酶的构象改变后，酶的活性中心被暴露出来，这就使得底物与酶活性中心结合的机率大大增加，这样可以加快反应进程[27]。但当达到一定程度后超声物理能量作用效果有减弱的趋势，超声时间过长，使得米渣蛋白质的结构发生变化，与蛋白酶的结合位点反而减少。

图6 超声时间对米渣蛋白提取率的影响

2.3 超声辅助酶法提取米渣蛋白工艺参数的正交试验优化

根据单因素试验结果，选择超声时间（A）、酶解时间（B）、加酶量（C）、料液比（D）、酶解温度（E） 为考查因素，分别选择4 个水平进行L16（45）正交试验。

正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果

根据直观分析极差R 值大小可以看出，5 个影响米渣蛋白提取率的因素的影响作用主次关系依次为D＞C＞A＞E＞B，说明料液比的影响最大，其次为加酶量、超声时间、酶解温度、酶解时间。初步确定最优的组合为A3B1C4D3E4，即料液比1∶10，加酶量1 650 U/g，酶解时间100 min，酶解温度55 ℃，超声时间80 min。对最佳组合进行验证试验得到蛋白质的提取率为82.80%。

3 结论

通过对比碱性蛋白酶单独作用、单独使用超声处理、超声处理辅助碱性蛋白酶等提取方式对米渣蛋白提取率的影响，得出超声协同碱性蛋白酶提取效果最佳。在单因素试验基础上，利用正交试验确定了最优组合超声辅助酶法提取米渣蛋白。

大米蛋白是一种优质的植物蛋白，诸多优良的特性使其应用前景得到了广泛的关注。采用超声波辅助碱性蛋白酶法纯化工艺，适宜的超声对提取米渣蛋白有利，能够提高碱性蛋白酶的活力，且安全可靠，对营养物质的影响也较少。同时，可以防止酶解温度过低而导致酶反应时间过长，有效缩短了酶解的时间，且酶法作用的条件温和，将超声与酶法有效结合，既而从米渣中得到高纯度的蛋白成分。