西北某市地下水源真菌种群及多样性特征分析

任 崴，黄廷林

(1.西安建筑科技大学 环境与市政工程学院 陕西省环境工程重点实验室，陕西 西安 710055;2.河南科技大学 建筑学院，河南 洛阳 471023)

饮用水安全问题关系到人类生命健康[1-2]，近年来，随着检测技术的提高和改进，饮用水中微生物的安全性受到更多的关注[3]，其中由真菌的繁殖带来的饮用水污染问题日趋普遍，逐渐受到重视[4].真菌在水源水中的生长不仅影响到了水体嗅觉[5]和味觉[6]上的不适，使水处理工艺变得复杂，而且其中致病性及潜在致病性菌的积累容易导致流行性疾病的发生[7].目前，国内外对真菌群落多样性及其潜在致病性研究多集中于土壤[8]、地表水[9]、自来水[10]、医院供水系统[11]等环境中，而对地下水源水中真菌污染的研究相对较少[12].

可培养微生物通常只占环境微生物总数的极小部分，传统的培养分离方法只能反映出部分的微生物信息[13]，很难反映出环境中微生物多样性的原始状态[14].目前利用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denature gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)这一分子生物学方法[15]对水环境中的真菌多样性研究已有报道，邸诗雨等[9]对西安市典型景观水体水质与微生物种群结构多样性研究发现不同水体真菌菌群结构存在明显差异，茎点霉属(Phomasp.)真菌是分布在城市景观水体中的优势种群.王风芹等[16]对贾鲁河水体微生物菌群结构季节动态变迁研究发现贾鲁河水体和底泥中细菌数量显著高于真菌和放线菌数量，水体中各类群微生物数量夏秋季高于冬春季，而底泥中细菌、真菌和放线菌数量春夏季略高于秋冬季.宣淮翔等[17]研究了太湖不同湖区水生真菌多样性发现子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)为优势种群，聚类及典型相关分析表明，太湖不同湖区水生真菌多样性存在差异，这与湖区间不同的营养水平、风浪扰动状况等因素有关.张利兰[18]对豫北黄河故道、山东黄河三角洲和河北白洋淀三个不同类型的湿地水体研究发现真菌主要分布壶菌纲(Chytridiomycetes 16.2%)，黑粉菌纲(Ustilaginomycetes 5.4%)，接合菌纲(Zygomycetes 2.7%)和绣菌纲(Urediniomycetes 21.6%)，三个湿地共有类群为Urediniomycetes，但分布在其不同的种属.

西北某市属暖温带半湿润大陆性季风气候，夏季炎热多雨，每到夏季高温时节，其常规水厂的地下水源水中真菌会大量繁殖，形成以丝状菌、放线菌等为主的微生物絮体，堵塞管道，增大水处理设施的负荷.本研究利用PCR-DGGE分子指纹图谱技术探究供水系统中真菌种属多样性、变化规律、优势种属等进行了对比分析，为进一步研究地下水源井中真菌污染控制等方面提供依据.

1 材料与方法

1.1 采样点概况

课题组研究对象西北某市北郊地下水源地共有54口井，常态化运行的有32口井[19].本研究在选取其中12个具有代表性的地下水源井为研究对象(表1).

表1 12个水源井概况

1.2 样品采集

2014年6月采集12个地下水样品，每个水样均取5 L用于水质分析和微生物群落结构分析，全程无菌操作.

1.3 水质指标测定

水质指标测定参照环保部出版的《水与废水监测方法》第四版中的标准方法，详见表2.

表2 水质分析方法及所用仪器

1.4 水体微生物总DNA提取

所用试剂盒为E.Z.N.A.®water DNA Kit(D5525)，美国OMEGA生物公司.主要步骤参考试剂盒使用说明书及王帅[20]论文中的方法

1.5 巢式PCR扩增和DGGE分析

实验中所用引物设计及扩增程序参考文献[9, 21]，详见表3.DGGE图谱采用Quantity One软件分析.

表3 真菌巢式PCR引物及条件

1.6 克隆测序

参照WU等的方法[22].

1.7 数据分析

Quantity One分析软件(Version 4.3.1，美国Bio-Rad公司)分析指纹图谱.软件分析所得的数据进行真菌多样性分析.

真菌的多样性水平采用如下指数考查:

Shannon多样性指数

H=-∑PilnPi

在盾构完成穿越桥梁桩基后，对穿越高铁影响范围内的管片，利用管片上的注浆孔自下而上进行二次注浆，浆液采取快速凝结的双液浆，注浆压力不大于0.4MPa，以确保管片壁后空隙填充饱满。

Pielou均匀度指数

J=H/lnS

2 结果与分析

2.1 水质特征

12个地下水水质检测数据见表4.由数据可以看出，12个水样的水温在18.4～20.8之间，整体变化不大.pH值显示水体呈弱碱性(8.38～8.78)，溶解氧浓度在8.0～10.5 mg/L之间，均在水环境正常范围内.

表4 12个水体水质指标分析

根据地下水环境质量(GB/T 14848-9)标准值(Ⅲ类)分析，12个水样中Fe(7，34号井)和Mn(16，37，39号井)水样超标.

2.2 DGGE 指纹图谱分析

如图1所示，DGGE图谱中的条带清晰，说明所选择的生物样本合适，样本的稀释梯度及DNA浓度满足检测的要求.在DGGE图谱中，每个泳道对应一个环境样本，每个泳道中不同位置的光亮条带代表一种真菌种属，位置不同真菌种属不同.多个泳道的同一位置的条带可说明该位置的真菌种属存在于每个环境样本中，通过上述分析以及相关软件根据条带亮度和数量所赋值计算相应的多样性指数.

图1泳道比较图中的百分数(%)是其余泳道与第7泳道结构的相似百分比.

如图1所示：12个样品通过巢式PCR-DGGE共分离出25个条带，12个环境样本的特征有相同点，也有不同，例如条带6、14和16是12个样品共有条带，条带23是第10(1)样品的特有条带.这说明真菌种属分布有一定的规律，DGGE图谱中，不同环境样本所得的条带数目并不相同，但对应的真菌种属有相同之处，说明一些真菌是多个环境样本所共有的，而一些环境样本中的某一条带有唯一性，说明这个条带对应的真菌种属是别的环境样本中所没有的.

图1 不同样品真菌DGGE图谱及泳道比较图

2.3 真菌群落结构相似性(Cs)分析

真菌群落结构相似性分析可以得出，34号井和36A号井样品的相似度最高，达63.3%，说明这两个样品的微生物群落结构相似程度比较高，而7号井和16号井样品的相似度最低，为20.4%.通过UPGMA算法对不同样点真菌菌群落结构相似性进行聚类分析，结果如表4所示，由图可知当Cs小于0.4时，样品分为4大族:7号井样品单独为一族，10(1)、41A、43和46号井样品为第二族，其余样品为第三族.不同样品比较，相邻样品真菌群落相似性较高，聚类位置相近.

表6 样品的相似性系数分析

2.4 真菌DGGE 条带基因片段测序分析

通过图谱分析，选择环境样本中的真菌种属最多作为目标条带，编号，然后进行割胶、测序.通过测序，将所测序结果与NCBI库进行表，相似度最高的已知真菌种属极大可能就是该条带对应的真菌种属[8]，详见表7.

图2 不同取样点真菌群落结构相似性的聚类分析

表7 DGGE条带的序列比对分析

由表7可以看出，6条序列与GenBank中序列的最大相似度都在97%以上.

其中尖刀链胞菌(Fusarium oxysporum)和暗球腔菌(Phaeosphaeria fuckelii)为12个水样中共同存在的真菌种属.

2.5 真菌与环境变量之间的相关关系

地下水体中的丝状真菌来源及生长繁殖是一个复杂的过程，可能受到来至于气候、降水、温度、地表环境及人类活动等方面的影响.但从另一方面分析，水体中的某些水质指标及营养物质可能是影响其在水体中生长繁殖的重要方面.

利用Excel 2003、Canaco 4.5等软件分析地下水源井中的真菌与常规水质指标之间的相关关系，结果如图3所示.从图3我们可以看出，真菌的生长和常规水质指标DO、pH、温度、浊度、铁、锰、TN、TP、氨氮、碱度、COD、TOC存在一定的相关性.不同种属的真菌与环境变量的相关性并不相同.pH值和温度和对镰刀菌属(Fusarium.sp)、青霉属(Penicillium.sp)的生长相关性较大.

图3 真菌与环境变量之间的相关关系

3 讨论

据推测，全世界的真菌种类约150万种，目前已经得到鉴定的(包括陆生、水生等约80 000 种)仅占其全部种类的5%左右[23].其中绝大部分不能用传统培养分离的方法进行研究.本文利用PCR-DGGE这一无需分离培养微生物的技术，来研究西北某市地下水源井水中真菌种群的分布特征.但该方法对于优势类群的一般只能鉴定到目或科，缺乏更为详细的分类学信息，有一定的局限性[17].

西北某市地下不同的水源井中真菌多样性指数、丰富度指数和均匀度指数分别为0.89～1.33、9～25 和0.405～0.460，表明该地区地真菌种类较为丰富，这与Elke等[24]人在对德国地下饮用水源的研究结论类似.影响水体中的真菌繁殖的因素很多，如温度及碳、氮[25]等营养物质[17]有关.地下水是一个相对封闭的环境，水源的补给相对复杂，由图1 DGGE图谱可以看出，不同的水源井水中既存在着共同的真菌种属也有各自特异的种属，说明不同的位置对其真菌种属有一定的影响，张利兰[18]对自然湿地水体真菌群落结构研究表明地理位置对其真细菌群落结构的分布是有明显的影响的.

通过PCR-DGGE技术得出各样品间的真菌群落相似性系数不尽相同，34号井和36A号井样品的相似度最高，达63.3%，说明这两个样品的微生物群落结构相似程度比较高，而7号井和16号井样品的相似度最低，为20.4%.地下水的补给、循环和流动是一个非常复杂的过程，不同水样之间的差异可能和其所处的不同的含水层有关.

同时，通过克隆测序得出的6条序列与GenBank中序列的最大相似度都在97%以上.其中尖刀链胞菌(Fusarium oxysporum)和暗球腔菌(Phaeosphaeria fuckelii)为12个样品中共同存在的真菌种属，另外，有相当一部分不可培养真菌存在于不同的水样中，并且尖刀链胞菌(Fusarium oxysporum)和暗球腔菌(Phaeosphaeria fuckelii)在纯培养试验中并未培养出(文中未列出纯培养实验结果).这也从另一方面佐证了PCR-DGGE技术作为研究微生物菌落组成及演化规律的有效方法[26].

地下水体中的丝状真菌来源及生长繁殖是一个复杂的过程，可能受到来至于气候、降水、温度、地表环境及人类活动等方面的影响.但从另一方面分析，水体中的某些水质指标及营养条件可能是影响其在水体中生长繁殖的重要方面[25].

利用Excel 2003、Canaco 4.5等软件分析地下水源井中的真菌与常规水质指标之间的相关关系，结果如图3所示.从图3可以看出，真菌的生长和常规水质指标DO、pH、温度、浊度、铁、锰、TN、TP、氨氮、碱度、COD、TOC存在一定的相关性.不同种属的真菌与环境变量的相关性并不相同.pH值和温度和对镰刀菌属(Fusarium.sp)、青霉属(Penicillium.sp)的生长相关性较大.Hamid Moh等人[25]的研究发现，真菌在C∶N比为1∶1时生长最为迅速，此外，pH值为5.5～6.5与其他pH值相比，显示出最佳的真菌生长条件.

尽管PCR-DGGE技术对水处理系统微生物群落结构演替规律的研究有重要意义.但PCR-DGGE技术检测的DNA片段受片段长度的限制，对较长的片段分离率下降，限制了用于系统发育分析和探针的序列信息量[27].不同类型真菌种群的rDNA有着相同的迁移行为，一条DGGE带可能代表几种菌，也可能不同的几条DGGE带代表同一种菌.另一方面，由于PCR、DGGE方法的灵敏度所造成的不能确定代谢活性、细菌数量和基因表达的水平等也是该技术的局限性.

4 结论

(1)西北某市地下水中真菌种类较为丰富，不同的水源井中既存在着共同的真菌种属也有各自特异的种属，真菌多样性指数、丰富度指数和均匀度指数分别为0.89～1.33、9～25 和0.405～0.460.

(2)对不同样点真菌群落相似性进行比较研究得出其相似性系数存在着一定的关系，相邻样点间相似性较高.显示优势类群主要分布于隐球菌属(Cryptococcussp.)、暗球腔菌属(Pluteussp.)、镰刀菌属(Fusariumsp.)、青霉属(Penicilliumsp.)四种类型真菌普遍存在于地下水源井中，同时也是地下水真菌中的优势种类.

(3)真菌的生长和常规水质指标DO、pH、温度、浊度、铁、锰、TN、TP、氨氮、碱度、COD、TOC存在一定的相关性.不同种属的真菌与环境变量的相关性并不相同.pH值和温度和对镰刀菌属(Fusariumsp.)、青霉属(Penicilliumsp.)的生长相关性较大.

(4)研究为地下水真菌污染控制提供了一定的理论依据.